【商检行业标准(SN)】 化妆品微生物检验方法 第1部分：沙门氏菌

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T2206.1—2008
化妆品微生物检验方法
第1部分：沙门氏菌
Method of microbiology examination for cosmetics-Part 1:Salmonella
2008-11-18发布
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
2009-06-01实施
本部分的附录A为资料性附录。
本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。SN/T2206.1—2008
本部分起草单位：中华人民共和国广东出人境检验检疫局、中华人民共和国上海出入境检验检疫局、中华人民共和国福建出人境检验检疫局、中华人民共和国深圳山人境检验检疫局、广州华峰生物科技有限公司。
本部分主要起草人：李志勇、王志强、李晓虹、郑晶、石磊、凌莉、易敏英、高东微、吕敬章、陈、胡科锋、许龙岩、黄晓蓉、曹以诚。本部分系首次发布的出人境检验检疫行业标准。1范围
化妆品微生物检验方法
第1部分：沙门氏菌
第一法常规培养法
SV/2206的本部分规定了化妆品中沙门氏菌的常规检验方法，本部分适用于化妆品中沙门氏菌的检验。2规范性引用文件
SN/T 2206.1--2008
T2206的本部分的引用而成为本部分的条款。凡是注日期的引用文下列文件中的条款通过SN/T
件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于部分，然而，鼓励根据本部分达城协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本，凡是不注月期的引用文件，其最新版本适用于本部分，
GB/T4789.4—2003食品微生物事检验(13/T4789.28-2003食品德
生勒学验
民菌检验
色法培养基和试封
C规格和试验方法（GB/T6682-2008IS03696：1987.MOD)(B/T6682分析实验率用水
GB/T7918.1化妆品微生物标准检验方祛总则WS/T230临床诊断中整合酶链区励（FR技术的放用ISO6579食品微生物学沙门氏菌检测水平法3材料与设备
3.1吸管：2mL，分刻度0.1mL
分刻度
3.2灭菌平血：直径90mI.底部平整的戒璃或3.3[00 .三角瓶。
3.4接种针、接种环，
3.5灭菌的样品处理具：镊了
3.6灭菌小试管3mm×50mm
3.7可调移液器：10μL-~100±.13.8天乎量程0~500，精度0.1#，3.9高压火菌器，
3.10冰箱：0℃~4℃
乳液分散机（转速000/min以上）。3.11
3.12恒温培养箱:36C±1℃、12C-1C，3:13显微镜：10X～100×
次性塑料灭平血
3.14VITEK全自动微生物鉴定系统或类似设备。注：VITEK是由法国生物梅单埃公司握供的产品的商品名。给出这一信息是为了方便本部分的使用者，并不表示对该产品的唯一认可。如果其他等效产品具有相同的效果，也可使用这些等效产品。4培养基和试剂
4.1SCD1.F液体培养基：按GB/T7918.1中规定。1
SN/T 2206.1—2008
四硫酸钠煌绿(TTB)增菌液：按GB/T4789.28—2003中4.14、4.15规定。亚硫酸铋琼脂（BS）：按GB/T4789.28—2003中4.19规定。DHL琼脂：按GB/T4789.28—2003中4.20规定。4.4
4.5HE琼脂：按GB/T4789.28—2003中4.21规定。WS琼脂：按GB/T4789.282003中4.23规定。4.6
SS 琼脂:按 GB/T 4789.28 2003 中 4. 22 规定。二糖铁琼脂：按GB/T4789.282003中4.26、4.27规定。4.9
蛋白陈水、靛基质试剂：按GB/T4789.28—2003中3.13规定。4.10
尿素琼脂（pH7.2）：按GB/T4789.28—2003中3.15规定。4.11
氰化钾(KCN)培养基：按GB/T4789.28—2003中3.16规定氨基酸脱羧酶试验培养基：按（B/T4789.28—2003中3.12规定。糖发酵管：按（B/T4789.28--2303中3.2规定。ONPG培养基：按GB/T4789.28—2003中3.3规定。半固体琼脂：按GB/T4789.28—2003中4.30规定。丙二酸钠培养基：按GB/T4789.28—2003中3.7规定。钞门氏菌因子血清：按26种用于初步分型，57种用于进一步分型，163种用于详细分型。API20E测试条。
GNI 测试卡。
让，API20E测成条和GNI+测试卡是内法国生物梅里埃公司提供的产品的商品名。给出这一信息是为了方便本部分的使用者，并不表示对该产品的唯一认可。如果其他等效产品具有相同的效果，也可使用这些等效产品。5检验程序
5.1方法提要
化妆品中沙门氏菌的检验方法是通过前增菌、选择性增菌、分离、生化鉴定、血清学分型鉴定等方法对化妆品中可能存在的沙门氏菌进行定性检验。5.2检验程序
沙门氏菌的检验程序见图1。
H;s+、脏基质一、尿素
KCN一,赖氨酸十
沙门氏菌一、
血清学试验
样品制备
样品10g(10 mL)制成1:10稀释液10mL稀馨液切入90mLSCDLP增萄液36 ℃±1
18h~24
10mLSCDLP增菌培养液加入100nlTTB增葡灌42 ℃±1
36 ±1 t
18 h~-24h
SN/T2206.1—2008
DHL (或HE、WS、SS)
1Bh~~24 h
挑选可疑菌落，接种TSJ、蛋白陈水（基质）尿景（pH7.2），KCN，剪氢酸生化试验或API，GNI鉴定试验
H,S +.鹿基质+、尿素-
KCN一-赖氨酸+
并露陈、山黎
沙门氏菌—
血清学试验
报告结架
H2S一、髋基质一、尿翼-
KCN一,模如酸+/
非沙门氏菌
图1检验程序
参照GB/T 7918. 1 进行制样
检验步骤
7.1前增菌和增菌
非如左述的
各种反应结果
非沙门菌
取1=10样品稀释液 10 mI.加到 90 mI. SCDI.P液体培养基巾,置培养箱 36℃士1℃培养 18 h~24h。移取10mL,转种于100 mL四硫酸钠煌绿(TTB)增菌液内,42℃±1℃培养 18h~24h。7.2分离
按（G13/T4789.4—2003中6.2规。7.3生化反应
按（G13/T4789,4—2003中6.3规定的生化反应，也可采用API20E，GNI+测试卡或其他等效产品。
7.4血清学分型鉴定
按GB/T4789.4—2003中6.4规定.7.5结果报告
综合生化反应和血清学鉴定结果，按（B/T4789.4—2003中6.5判定菌型，并报告结果。3
SN/T 2206.12008
8范围
第二法环介导恒温扩增(LAMP)法SN/T2206的本部分规定了化妆品中沙门医菌的1.AMP检验方法。本部分适用于化妆品中沙门氏菌的快速检验。9缩略语
下列缩略语适用于SN/T2206的本部分。9. 1 Retaine
甘氮氨酸三甲内盐，
9.2Bst 酶Bst DNA polymerasecLarge FragmentBst IDVA 聚合酶(大片段)。
9.3 DNAdeoxyribonucleic acid脱氧核糖核酸。
9. 4 dNTP deoxyribonucleoside triphosphate脱氧核苷三磷酸。
9.5 EDTA ethylenediamine letraaceuc acid乙胺四乙酸。
9.6LAMP loop-mediated isothermal awyplleation环介导恒温扩增，
9.7 PCk polymerase chain reaction聚合酶链式反应，
9.8Tritol X-100
聚乙二醇辛基苯基醚。
10防污染措施
参照WS/I230中第6章。
11原理
基因序列设计的两对特殊的内、外LAMP是一种连续、恒温、基于菌反血的核酿扩增技术。根费翻
引物，特异性识别靶序列上的八个独立利用s酶启动环置换反应。在靶标DNA区启动互补链合成，结果在同一链上互补序列周而复始形成有很多环的花椰莱结构的茎-环DNA混合物，I.AMP反应过程中，从dNTP析山的焦磷酸根离子与反应溶液中的Mg*-结合，产生副产物（焦磷酸镁）形成乳白色沉淀，人显色液，即可通过肉眼观察判定结果，12设备和材料
12.1设备
一次性手套、移液器(量程 0. 5 μl. 到1 000 pL)、枪头、1. 5 mL塑料离心管、1. 5 mL离心管架、计时器、冰盒.高速台式离心机、水浴锅或加热模块等、12.2引物
根据沙氏菌属特有的靶序列αfA设计一套特异性引物,包括外引物1、外引物2和内引物1、内引物2，
外引物扩增片段长度：200bp。
12.3检测试剂
A）样品预处理液：成分包括Tris-H(lipH8.07,FI)TA，TritonX-lon；SN/T 2206.12008
b）反应液，主要成分dNTP，Tris-HCILpH8.8],MgSO.，T'ritonX-1oo，Betaine，内/外引物#c）DNA 聚合酶:Bst酶
d）显色液：
沙门氏菌I.AMP检测试剂盒：试剂盒组成、说明及使用注意事项参见附录A。注：由指定单位提供，给出这一信息是为了方便本部分的使用者，并不表示对该产品的唯，认可。如果其他等效产品具有同的效果，则可使用这些等效产品，13检测程序
化妆品中沙门氏菌LAMP方法检测程序见图2特
族托性培离酒
加需受咖
LAMP友息
法确认
图2检验程序
14操作步骤
14.1样品制备、增菌培养和分离样品制备参照GB/T7918.1进行。增菌培养和分离按7.1~7.2规定。14.2细菌模板DNA的制备
14.2.1增菌液模板DNA的制备
对于14.1方法培养的增菌液：免费标准bzxz.net
a）宜接取该增菌液1 ml,加到 1.5 ml,光菌离心管中,10 000 r/nlin 离心2 rmin,尽吸弃1清液：
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b）加人80μi.样品顶处理液，混匀后沸水浴10min，置冰上10min：c）100001/min离心2min，上清液即为核酸模板，取上液置一20℃可长期保存备用。14.2.2可疑菌落模板DNA的制备
对于14.1方法分离到的可疑菌落，可直接挑取可疑菌落，加入80ul.样品预处埋液，再按照J4.2.1b)步骤制备模板DNA以待检测。也可使用等效的商品化的DNA提取试剂盒并按其说明提取制备模板DNA。14.3核酸扩增
14.3.1反应过程
在向上述2μ[.核酸模板L见14.2.1c)]中加人23πI扩增液（参见表1））65℃温育90min
表1LAMP反应体系
沙门氏菌反应液
Bst 酶
TNA模板
吃备液浓度
BU/μL
注1：沙门氏菌反应液与Bst酶混合液即为扩增液：注2，每次反应必须设置阴性和阳性各一个质控。14.3.2阴性对照阳性对照设置
25 μL反应体系中加样体积/μ122 μl.
阴性对照设为I.AMP反应的空口对照（以样品预处理液代替DNA模板）。阳性对照采用口知浓度的沙门J氏菌标准菌株DNA溶液作为LAMP反应的模板。14.3.3LAMP反应体系
常规LAMP反应体系见表1。
14.4结果观糜
在上述反应管中加人1μI.显色，轻轻混匀即可判定结果：建议在黑色背景下观察，建议使用LAMP试剂盒专用反应管，将反应液和显色液一次性加人，DNA扩增反应后可不必开盖即可观察结果。
14.5结果判定
在阴性对照反应管液体为色，阳性对照反应管液体呈绿色的条件下：待捡样品反应管液体坚绿色，该样品结果为沙门氏菌初筛阳性，采用样品增菌渡或纯菌落进-a）
步按7.3~-7.5步骤逃行确认后报告结果；b）待检样品区应管液体呈橙色则可报告沙门氏菌检验结果为阴性、若与上述条件不符，则本次检测结果无效，应重新检测。6
4.1试剂盒组成
附录A
（资料性附录）
沙门氏菌LAMP检测试剂盒
每个试剂盒（20T/kit，每个反应体系体积为25μl.)包括的成分见表Λ.I表A.1
组成成分
DNA提取波
沙门氏菌反应被
Bst酶
显色被
沙门氏菌阳性对照 DNA
L.AMF反应专用管
A.2说明
反应液中含有特异性引物及各种离子；规格
SN/T 2206.1-—2008
1管,1,5 ml.
1管，500μl.
1管,30 ±l
25管，1 μ./管
1管，50μl.
扩增试剂[见14.3.a)]的配制:反应液22 μL与Bst酶1L混匀即;c）LAMP反应专用管已含显色液。A.3
使用注意享项
严格执行行业行政主管部门颁布的有关基因扩增检验实验牵的管理规范；本试剂盒仅用于体外检测，开始检测前要仔细阅读试剂盒说明书全文；试剂盒内各试剂使用前，充分融化后稍离心。反应液分装时应尽量避免产生气泡，反应前注意检查各反应管是否盖紧以免泄露污染仪器，试剂盒内的阳性对照应视为其有污染性物质·应注意避免污染其他样品和反应试剂，导致错d)
误检验结果。
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