【农业行业标准(NY)】 玉米品种鉴定 DNA指纹方法

ICS65.020.01
中华人民共和国农业行业标准
NY/T1432—2007
玉米品种鉴定
DNA指纹方法
Maize Variety Identification Molecular Techniques2007-09-14发布
2007-12-01实施
中华人民共和国农业部
1范围
玉米品种鉴定DNA指纹方法
KArKAca=
NY/T1432—2007
本标准规定了玉米(ZeamaysL.)品种DNA指纹鉴定的实验方法及判定标准。本标准适用于玉米自交系和单交种的品种鉴定，其他杂交种类型及群体和开放授粉品种可参考本标准。
2规范性引用文件
下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准。然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GB/T3543.2农作物种子检验规程扦样GB4404.1粮食作物种子禾谷类
GB/T19557.1一2004植物新品种特异性、一致性和稳定性测试指南总则3原理
从玉米种子、幼苗、叶片等组织中提取DNA，利用SSR引物进行PCR扩增，不同碱基长度的PCR扩增产物通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，并通过染色显示DNA指纹谱带类型。不同玉米品种由于遗传组成不同，基因组DNA中简单重复序列的重复次数有差异，这种差异可通过PCR扩增、电泳、染色程序获得的DNA指纹图谱加以区分，从而对不同品种进行鉴定。4·仪器设备及试剂
仪器设备及试剂名单见附录A。
5溶液配制
相关溶液配制方法见附录B。
6操作程序
6.1样品准备
6.1.1取样量
每份送检样品至少检测5个个体，对一致性差的样品应增加检测个体至10个以上。如果检测品种为自交系，应剔除杂交种个体；如果检测品种为杂交种，应剔除自交系个体。6.1.2品种比较方式
成对品种的比较：送检样品提供两份，一份为待检品种，一份为对照品种。将待检品种与对照品种直接进行成对比较。
品种与DNA指纹库人库品种的比较：送检样品提供一份。将待检样品与DNA指纹库所有人库品种的指纹进行比较，筛选出指纹最相似或相同的品种作为待检品种的近似品种，然后将待检品种与近似品种直接进行成对比较。
6.2DNA提取
NY/T1432--2007
提供两种DNA提取方法，分别适用于不同的实际需要。a）方法一：剥取单粒干种子的胚，放入1.5mL离心管中，加入100μL氯仿后研磨，加人300μLDNA提取液1，混匀后于10000rpm离心2min，吸上清液加人预先装有300uL异丙醇和300μLNaCI溶液的1.5mL离心管中，待DNA成团后挑出，经70%乙醇洗涤后加人200LTE缓冲液1,待充分溶解后备用。适用于需要DNA提取量大和长期存放的情况。b）方法二：剥取单粒干种子的胚，或将玉米种子发芽，当玉米幼苗长度达到3cm左右，每株幼苗取1.5cm，剪碎，将样品分别放入96孔深孔板中，每孔加人150LDNA提取液2，沸水加热5min，然后每孔再分别加人150μLTE缓冲液2，直接取2uL进行SSR扩增，或4℃保存。适用于需要高通量快速提取的情况，同时适用于种子和幼芽DNA提取。6.3PCR扩增
6.3.1 SSR 引物
基本核心引物名单见附录C。
6.3.2反应体系
反应液体积为20uL，组分配制应符合表1的规定。表1PCR扩增反应体系
反应组分
10xBuffer
Tag酶
6.3.3反应程序
原浓度
25mmol/L
2.5mmol/Leach
20μmol/L
终浓度
2.5mmol/L
0.15mmol/Leach
0.25 μmol/L each
反应体积
94℃预变性5min1个循环；94℃变性40s60℃退火35s，72℃延伸45s，共30个循环；72℃延伸5min，4℃保存。
6.4变性聚丙烯酰胺凝胶电泳
6.4.1清洗玻璃板
用自来水沾洗涤灵将玻璃板反复擦洗干净，双蒸水擦洗两遍，95%乙醇擦洗两遍，干燥。在长板上涂上0.5mL亲和硅烷工作液，带凹槽的短板上涂0.5mL剥离硅烷工作液。操作过程中防止两块玻璃板互相污染。
6.4.2组装电泳板
待玻璃板彻底干燥后组装电泳板，并用水平仪调平。6.4.3灌胶
在100mL4.5%PAGE胶中加人TEMED和25%过硫酸铵各100uL，迅速混匀后灌胶。待胶流动到下部，在上部轻轻插人梳子，使其聚合至少1h以上。灌胶过程中防止出现气泡。6.4.4预电泳
在正极槽（下槽）中加人1×TBE缓冲液600mL，在负极槽（上槽）加入预热至65℃的1×TBE缓冲液600mL，拔出梳子。90W恒功率预电泳10min~20min。2
6.4.5变性
HKAoNrKAca-
NY/T1432-—2007
在20μLPCR样品中加人4μL6×加样缓冲液，混匀后，在PCR仪上运行变性程序：95℃变性5min，4℃冷却10min以上。
6.4.6电泳
用移液器吹吸加样槽，清除气泡和杂质，插入样品梳子。每一个加样孔点入5L样品。80W恒功率电泳至上部的指示带（二甲苯青）到达胶板的中部（约40min）。电泳结束后，小心分开两块玻璃板，凝胶会紧贴在长板上。
6.5银染
6.5.1固定：固定液中轻轻晃动3min；6.5.2漂洗：双蒸水快速漂洗1次，不超过10s；6.5.3染色：染色液中染色5min；6.5.4漂洗：双蒸水快速漂洗，时间不超过10s；6.5.5显影：显影液中轻轻晃动至带纹出现；6.5.6定影：固定液中定影5min；6.5.7漂洗：双蒸水漂洗1min。
7结果及判定
7.1数据表示
以多数个体具有的谱带即主带作为品种的特征谱带（如果检测品种为自交系，应剔除杂交种个体：如果检测品种为杂交种，应剔除自交系个体），当无法判断主带时，给出各种谱带所占的比率。谱带记录方式：每个核心引物的所有谱带按扩增片段从大到小的顺序编号，用二位代码描述（依次为01、02......），并确定代表每条谱带的一套标准品种。每个待测品种在每个引物位点上的谱带号用四位代码描述，对照标准品种确定待测品种的谱带号。示例1：在一个核心引物上仅有一条谱带02，品种在该引物位点的谱带代码为0202；示例2：在一个核心引物上有两条谱带02和03，品种在该引物位点的谱带代码为0203。7.2检测及判定标准
7.2.1先用20对基本核心引物检测，获得待测品种在20个引物位点的DNA指纹谱带数据，利用20个位点的DNA指纹谱带数据进行品种间比较：a）品种间差异位点数≥2，判定为不同品种：b）品种间差异位点数=1，判定为相近品种；c）品种间差异位点数=0，判定为疑同品种。7.2.2对b)和c)的情况，必要时继续用20对扩展核心引物进行检测，利用40个位点的DNA指纹谱带数据进行品种间比较：
a）品种间差异位点数≥2，判定为不同品种；b）品种间差异位点数=1,判定为近似品种；c）品种间差异位点数=0，判定为相同品种或极近似品种。7.3鉴定报告
鉴定报告书格式参见附录D。
NY/T1432—2007
A.1仪器设备
A.1.1PCR核酸扩增仪：规格为96孔；A.1.2序列分析电泳槽；
附录A
(规范性附录）
仪器设备及试剂
A.1.3高压电泳仪：规格为3000V，400mA，400W；水平摇床；
胶片观察灯；
A.1.6电子天平；
微量加样器；Www.bzxZ.net
磁力搅拌器；
电磁炉；
微波炉；
高压灭菌锅；
pH酸度计。
A.2试剂
所用试剂均为分析纯，所用水均为去离子水。A.2.1乙二胺四乙酸二钠；
Tris碱；
A.2.3盐酸；
4氢氧化钠；
10×Buffer缓冲液：不含Mg2+：四种脱氧核苷酸：4×dNTP；
TagDNA聚合酶；
SSR引物；
矿物油；
A.2.10去离子甲酰胺；
溴酚蓝；
二甲苯青FF；
A.2.13甲叉双丙烯酰胺；
丙烯酰胺；
硼酸；
5尿素；
亲和硅烷：97%；
剥离硅烷：2%二甲基二氯硅烷；无水乙醇；
四甲基乙二胺（TEMED)；
过硫酸铵；
冰醋酸；
硝酸银；
甲醛溶液：37%。
KANKAca
NY/T1432—2007
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B.1DNA提取溶液的配制
附录B
（规范性附录）
溶液配制
B.1.10.5mol/LEDTA溶液：186.1gNazEDTA·2H2O溶于800mL水中，用固体NaOH调pH至8.0，定容至1000mL，高压灭菌。B.1.21mol/LTris-HCI溶液：60.55gTris碱溶于适量水中，加HCI调pH至8.0，定容至500mL，高压灭菌。
B.1.30.5mol/LHCl溶液：25mL浓盐酸(36%~38%），加水定容至500mL。B.1.4DNA提取液1:1mol/LTris-HCI50mL,0.5mol/LEDTA50mL,5mol/LNaCl50mL,SDS7.5g，定容至500mL。
B.1.5DNA提取液2:2g固体NaOH溶于水中，加水定容至500mL。B.1.6TE缓冲液1:1mol/LTris-HCI5mL,0.5mol/LEDTA1mL，加HCI调pH至8.0,定容至500mL。
B.1.7TE缓冲液2:1mol/LTris-HCI5mL,0.5mol/LEDTA1mL,0.5mol/LHCI100mL,定容至500mL
B.1.85mol/LNaCI溶液：146g固体NaCI溶于水中，加水定容至500mL。B.2PCR扩增溶液的配制
B.2.1dNTP：用超纯水分别配制A,G、CT终浓度100mmol/L的储存液。各取20μL混合，用超纯水720uL定容至终浓度2.5mmol/Leach的工作液。B.2.2SSR引物：用超纯水分别配制前引物和后引物终浓度均40umol/L的储存液，等体积混合成20umol/L的工作液。注：干粉配制前应首先快速离心。B.2.36×加样缓冲液：去离子甲酰胺49mL,0.5mol/L的EDTA溶液（pH8.0)1mL，溴酚兰0.125g，二甲苯青0.125g。
B.3变性聚丙烯酰胺凝胶电泳溶液的配制B.3.140%PAGE胶：丙烯酰胺190g和甲叉双丙烯酰胺10g，定容至500mL。B.3.24.5%PAGE胶：尿素450g,10×TBE缓冲液100mL，40%PAGE胶112.5mL，定容至1000mL。
B.3.3Bind缓冲液：49.75mL无水乙醇和250μL冰醋酸，加水定容至50mL。B.3.4亲和硅烷工作液：在1mLBind缓冲液中加人5μLBind原液，混匀。B.3.5剥离硅烷工作液：2%二甲基二氯硅烷。B.3.625%过硫酸铵溶液：0.25g过硫酸铵溶于1mL超纯水中。B.3.710×TBE缓冲液：Tris碱108g，硼酸55g0.5mol/LEDTA溶液37mL，定容至1000mL。B.3.81×TBE缓冲液：10×TBE缓冲液500mL，加水定容至5000mL。6
B.4银染溶液的配制
B.4.1固定液：100mL冰醋酸，加水定容至1000mL。B.4.2染色液：2g硝酸银，加水定容至1000mL。B.4.3显影液：1000mL蒸馏水中加人30g氢氧化钠和5mL甲醛。-iiKANikAca
NY/T1432--2007
NY/T1432--2007
引物名称
bnlg439
bnlg2331
bnlg125
mmc0191
umc2105
bnlg1496
phi072
bnlg2291
umc1705
umc1225
bnlg161
phi299852
bnlg1792
phi116
umc1741
phi080
染色体位置
附录C
（规范性附录）
基本核心引物名单
引物序列
Left End:TTGACATCGCCATCTTGGTGACCARight End:TCTTAATGOGATCGTACGAAGTTGTGGAALeft End:TCIGATATCATAAAGGAGGACOGRight End:GGAGCTTGCGCTTTTTAACALeft End:GGGACAAAAGAAGAAGCAGAGRight End:GAAATGGGACAGAGACAGACAATLeft End:GGTGTTCAGTGTGAAAGGTTARight End:AAGATTTCCGCAAGGTTAAACLeft End:ACATACATAGGCTOCCTTTTTCCGRight End:TCCOGTGACACTCTCTTTCTCTCTLeft End:CTGGGCAGACAGCAACAGTARight End:AGOCAAAGACATGATGGTCCLeftEnd:ACCGTGCATGATTAATTTCTCCAGCCTTRight End:GACAGCGCGCAAATGGATTGAACTLeft End:CCTCTCGATGTTCTGAAGCCRight End:GTCATAACCTTGCCTCCCAALeftEnd:ATCTCACGTACGGTAATGCAGACARight End:CATGACCTGATAAACCCICCTCTCLeftEnd:CTAGCTCCGTGTGAGTGAGTGAGTRight End:TTCCTICTTTCTTTCCTGTGCAACLeft End:GCTTTCGTCATACACACACATTCARight End:ATGGAGCATGAGCTTGCATATTTLeft End:GATGTGGGTGCTACGAGCCRight End:AGATCTCGGAGCTCGGCTALeft End:CGGGAATGAATAAGCCAAGARight End:GCGCTCCTTCACCTTCTTTALeft End:GCATACGGCCATGGATGGGARightEnd:TCCCTGCCGGGACTOCTG
Left End: AGACGAACCCACCATCATCTTTCRightEnd:CGCTTGGCATCTCCATGTATATCTLeft End:CACCCGATGCAACTTGCGTAGARight End: TCGTCACGTTCCACGACATCAC编号
引物名称
phi065
bnlg1191
umc2163
bnlg1450
染色体位置
附录c（续）
引物序列
Left End:AGGGACAAATACGTGGAGACACAGRight End: CGATCTGCACAAAGTGGAGTAGTCLeft End: AATCATGCGTAGGCGTAGCTRight End: GCCAGAGGAAAAAGAAGGCTLeft End: AAGCGGGAATCTGAATCTTTGTTCRight End:GAAATTGCTGGGGTTCTCATTTCTLeft End:ACAGCTCTTCTTGGCATOGTRight End: GACTTTGCTGGTCAGCTGGT-riKAoNrKAca-
NY/T1432—2007
NY/T1432-2007
整定品种编号
鉴定品种名称
委托单位
依据标准
审批机关
测试单位
报告完成地点和日期
DNA指纹鉴定结果和结论：
检测引物数量：
差异位点数量：
结论：
评语：
制表人：
附录D
（资料性附录）
玉米品种DNA指纹鉴定报售书
对照品种编号
对照品种名称
测试日期
鉴定单位名称(公章）
审核人：
批准人：
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