【水产行业标准(SC)】 水产品中已烯雌酚残留量的测定 酶联免疫法

1CS 67.050
中华人民共和国水产行业标准
SC/T3020—2004
水产品中己烯雌酚残留量的测定酶联免疫法
Determination of diethylstilbestrol residues in fishery productsEnzyme linked immuno sorbent assay2004-01-07发布
2004-03-01实施
中华人民共和国农业部
S发布
本标推的附录A和附录B均为资料性附录。本标准出中华人民共和国农业部提出。SC/T3020—2004
本标准起节单位：中国水产科学研究院长汀水产研究所、农业部淡水鱼类种质监督检验测试中心。本标准主要起草人：艾晓辉、刘长征、邹世半、徐忠法、李荣。省
市场与
济信息处
1范固
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水产品中己烯雌酚残留量的测定、酶联免疫法本标谁规定了水产品中己烯雌酚残留量的酶联免疫测定方法。本标准适用十水产品肌肉中已烯雌酚的测定。2规范性引用文件
下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的与用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注月期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法3原理
测定的基础是竞争性酶联免疫抗原抗体反应，所有的免疫反应都在微孔中进行，加人已烯雌酚标准或样品溶液、已烯雄酚酶标记物、己烯雌酚抗体后，已烯雌酚与已烯雌酚酶标记物相互克争已烯雌酚抗体的结合位点。结合的已烯雌酚酶标记物可以将无色的发色剂转化为蓝色的产物，在450nm1处检测，吸收光强度与样品中的已烯雌酚浓度成反比，按校正曲线定量。4试剂和材料
本标准所用试剂除标明外，其他均为分析纯及其更高纯度，试验而水符合CB/T6682一级水标准。4.1叔丁基甲基醚：色谱纯。
4.2石油醛。
4.3二氯甲烷。
4.4甲醇：色谱纯。
4.5氢氧化钠:1mol/L。
4.6磷酸：6tnol/L
4.720%甲醇的20 mmol/L三羟基甲基氨基甲烧（Tris)缓冲液（pH8.5),40%、70%、80%的甲醇溶液，此溶液现用现配。
4.8671nIul/L磷酸盐缓冲液（pH7.2）：9.61g磷酸氨二钠，1.79g磷酸二氢钠溶解丁蒸馏水，定容至1000mL,此溶液现用现配。
4.9已烯雌酚酶联免疫定量测定试剂盒，参见附录A。5仪器与设备
5.1酶标仪：波长450nmg
5.2离心机：转速4000r/min:
5.3氮吹仪。
5.4电热恒温水溶锅。
5.5高速勾浆机。
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5.6Ci固相提取柱：长6.5cm，内径0.7cm。5.7固相萃取器，
5.8微型游涡混合仪
5.9振荡器。
5.10微量加样器：20μL50uL、100L、250、1000μ5.11微量多通道加样器：50uL、100L。6样品处理
6.1试样提取
取出鱼、虾,蟹、整等水产品肌肉部分,除净脂肪和结缔组织,样品切成不大于0.5 cm×0.5 cm×0.5cm的小块后混勾，置冰箱中冷冻备用。将样品解冻，取5g（精确到0.0lg)样品于匀浆机的玻璃管中，加10mL67mmol/l磷酸盐缓冲液(pH7.2),充分匀浆，称取3g(精确到0.01g)匀浆组织于20InL玻璃离心管中,加入8ml.叔丁基甲基醚，强烈拆荡20min，4000t/min离心10min，转移出上清波至20mL玻璃离心管中，再用8ml.叔基甲基醚重复提联沉淀物，将两次提取的醚相合并，70它水浴蒸发至干：取70%的甲醇1ml.溶解于燥的残留物，加3mL石油醚洗涤甲醇溶液，漩涡混合1min，4000r/min离心1Irin，吸除石油醚，置水浴锅中蒸发甲醇溶液，用1mL二氯甲烷溶解，加1nol/L氢氧化钠溶液3ml.,游涡振荡后静置，取出上层氢氧化钠溶液，加入6mol/L磷酸300L中和提液，用Clg固相提取柱进一步纯化。
6.2样品纯化
将C1s固相提取柱垂直固定，用3mL无水H醇洗涤柱广，再用2ml20%甲醇的20)mrmol/Tris缓冲液（pH8.5)平衡柱子，紧接着将上述用磷酸中和后的氢氧化钠提取液用1000αL微量加样器全部加入柱中，过柱，然后用2mL20%甲醇的20mmmol/.Ttis缓冲液（pH8.5)洗涤柱子，接着用3tIL40%的甲醇洗涤柱了，弃去过柱的溶液，用正压去除残留的液体并且用空气或氮气吹2min以于燥柱了！用2mL80%的醇洗脱样品（以上溶液洗柱、平衡柱和提取液过柱的流速皆为1滴/s左右，可固相萃取器抽真空控制），收集洗脱液，向洗脱液中加人2mL水，取20ml.进行酶联免疫测定。7酶联免疫测定
检查试剂盒中所有试剂是否齐全完好（参见附录A）。控制室温至20℃~24℃，取山足够数量的微孔条插入微孔架中，加入20μL的标准液和处理好的样品到各自的微孔底部，记录各标准液和样品的位置，标准和样品做两个平行实验。每个微孔中加入50稀释后的己烯雌酚抗体，微旋振荡混合，置2℃～8t冰箱中孵育20h
取出微孔架，回复到室温20℃；～24℃，洗板（甩出孔中的液体，将微孔架倒置在吸水纸上每行拍打3次，以保证完全除去孔中的液体。用250.蒸馏水充入孔中，再次倒掉微孔中液体，再重复操作两次），加入50稀释的酶标记物到微孔底部，微旋振荡充分混合后，置室温孵育1h，再洗板后（同上述洗板方法），每个微孔中加人50灿基质和50证发色试剂，充分混合，并在室湿暗处孵育30min，每个微孔中再加人1(H)μL反应停止液,混合后在60min内测量并记录每个微孔450 nm处的吸光度值：8结果计算
8.1计算相对吸光度值
计算每个己烯雌酚标准液和样液的平均吸光度值，按公式（1)求11已烯雌酚标准液和样液的相对吸光度值。
式中：
R - A/A.×1)此内容来自标准下载网
R，——相对吸光度值，单位为分比（%)；Ao空白标准的吸光度值；
一标准或样品的平均吸光度值。A.
8.2绘制校正曲线
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以计算的标准液相对吸光度值为纵坐标，以已烯雌酚浓度的对数为横坐标，绘制出已烯雌酚标液相对吸光度值与己烯雌酚浓度的校正典线（参见附录B），校正曲线在0.05g/.0.4/L范围内应当成为线性，相对成应每一个样品的已烯雌酚浓度可以从校正曲线上读出。每次试验均应重新绘制校正曲线。
8.3结果计算
在8.2绘制的校正曲线上读出的相对应每：-个样品的已烯雌酚浓度乘以相对应的稀释系数（本标准所采用的稀释系数为4)，即为试样中的已烯雌酚线留量。9检测限、回收率
9.1检测限
本方法的检测限为0.6g/kg。
9.2回收率
本法的回收率含70%。
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附录A
【资料性附录】
己烯雌酚酶联免疫定量测定试剂盒A.1已烯雌酚酶联免疫定量测定试剂盒已烯雌酚测定试剂盒由德国R-Bioptiatin公可制造1)，可用于肌肉、尿、胆汁、粪便及肝脏中的己烯雌酚残留检测，试剂盒应保存在2℃～8℃的干燥避光环境中，并在有效期内使用，试剂变质应当弃掉2)。所有试剂应达到室温20～24C后使用，每个试剂盒包括：1×框架,96孔板(12条×8孔)包被有兔抗己烯雌酚的抗体(免均G抗体）6×标准液（1.3mL/瓶），为40%的己已烯雌粉甲醇水溶液：0g/.0.025g/1.0.051格g/0.1格g/L.0.2 μg/L.0.4jg/.
1×已烯雌酚过氧化物酶标记物浓缩液(0.7mL)。1×己烯雌酚抗体浓缩液(0.7m)。1×酶基质(7mL):含有过氧化脲。1×发色剂(7 mL):四串基联苯胺。1 ×反应停止液(14 mlL):1 mol/L硫酸。1×缓冲液(25ml.)。
A.2已烯雌酚酶标记物的稀释
用试剂盒提供的缓冲液以1:11的比例，在玻璃试管中稀释酶标记物浓缩液，轻轻地振摇，充分混勾后使用（由于稀释的酶标记物稳定性不，所以只稀释实际需用量的酶标记物）。A.3己烯雌酚抗体的稀释
用试剂盒提供的缓冲液以1:11的比例，在玻璃试管中稀释抗体浓缩液，轻轻地振摇，充分混句后使用由稀释的抗体稳定性不好，所以只稀释实际需加量的抗体。1】德国R-Biopharm公司生产的已烯雌酚测定试剂盒是适合的市售产品的实例。给l这一信想是为了方便本标谁的使用者，并不排除运用同等性能的其他产品。2）发色试剂有任何颜色，表明发色剂已变质：空白标准的吸光度值小！0.6个单位(Λ5Um<0.6)时,表示试剂可能变质。
附录B
[资料性附录]
己烯雌酚的标准曲线
已烯雌酚浓度,附
已烯雌酚的标准曲线
SC/T 3020—2004
SC/T3020-2004
中华人民共和国
水产行业标准
水产品中己烯雕酚残留量的测定酶联免疫法
S:/T 3020—2004
中国农业出版社出版
（北京市朝阳区麦子店街18号楼）(邯政编码：10H126
网址：ccap.com.cn)
中国农业出版社印刷厂印刷
新华书店北京发行所发行：各地新华书店经销*
开本 880mm × 1230mm 1/16
2004 年2 月第1版
印张0.75
字数7千字
2004年2月北京第1次印刷
书号：16109·302
印数：1～1 000 朋
定价：8.00元
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