【国家标准(GB)】 水产饲料安全性评价 急性毒性试验规程

ICS65.120
中华人民共和国国家标准
GB/T 224872008
水产饲料安全性评价
急性毒性试验规程
Principle of ayualeed safety evaluation--Acute toxicity test2008-11-04 发布
中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中国国家标准化管理委员会
2009-02-01实施
GB/T22487—2008
质对谈水鱼(斑马鱼)急让毒性测定方法》和本标雅是在套阅了GB/T13267—1991水薇GB15193.3—2003《急性毒性试验》及国内外相关文献的基础上，根据我国技术发展水平研究制定的。本标准的附录 A 和附录 B为规范性附录。本标谁由全国慎料工业标雅化技术委员会提出并归！。本标准起草单位：中国农业科学院饲料研究所、国家水产饲料安全评价基地本标雅主要起草人：薛敏、刘海燕、昊旁哗，1
1范围
水产饲料安全性评价
急性毒性试验规程
本标准规定了水产饲料安全性评价急性荐性试验规程的基本技术要求。GB/T 22487—2008
本标准适用于水产饲料原料及水产饲料添加剂的安全性评价，不包括饲料药物添剂。2规范性引用文件
下列文件中的条款还过本标准的引用而成为本标的条款。凡是在日期的引用文件，其随后所有的修改单不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然面，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文作，其最新版本适用于本标准。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法（GB/T6682—2008.1S）3696：1987M0D）GB11607造业水质标准
3术语和定义
下列术薪和定义适用于本标准。3. 1
接触致毒法touching test
将受试物按照一定浓度梯鹿溶解稀释于水，然后放人试验水产动物。3.2
口服致毒法oral testwwW.bzxz.Net
将受试物一次或分次饲喂或灌服给试验动物。3. 3
注射致毒法injection lest
将受试物配成一定浓度的溶液，按试验动物的体重用注射器直接将一定录的受试物溶液作腹腔或肌肉注射。
半数教死浓度medianlethal concentration;LCao接触致毒后，引起动物死亡率为50%的水体中受试物的浓度，该浓度为经过统计得出的估计值，其单位是每升水体中受试物的叠,以毫克每升(mg/L)或克每升(g/L)表示。3.5
半数致死剂量medlanlethaldose;I.Dsa经口或注射给予受试物后，预期在一定时间内能够引起动物死亡率为50%的受试物剂量。该剂量为经过统计得出的估计值。其单位是每千克体章所摄人注射避人的受试物的量，以毫克每千克体重(mg/kg体重）.克每于克体重(g/kg体重）或寒升每于克体重(mL/kg体重）表示。3. 6
最大耐受剂量(MTD)法test of maximum tolerated concentralion (dose)用最大使用浓度和最大口服或注射容给予至少 10 尾试验水产动物后,连续观察 7 d～14 d,未见1
GB/T 22487—2008
任何动物死亡，则MTD大于该浓度（mg/L>名/kg体重）。3.7
静水式试验static water test
采用接触致毒法时，试验水产动物所在容器内的试验溶液处于静止状态，试验期闻不更换试验溶液。静水式试验只适用于在试验期间稳定面又耗氧不高的受试勃。3.8
换水式试验semi-static water test采用接触致毒法时，每24h或更短的时间内更换一次间种试验浓度试验液，更换时闻根据受试物的稳定性确定，保证波动范围在初始值的20%之内。可用于受试物浓度在更换试验液的时间内相对稳定的试验。
流水式试验flow-through test
采用接触致幕法时，试验液连续更新，可用于大多数物质，包括水中不稳定的物质。3. 10
recirculation systen
循环水养殖系统
养殖用水在系统内经过净化处理肩循环便用的养殖系统3.11
流水养殖系统flow-through system求来自系统外的养殖用水连续或闻默地流经养殖容器的养殖系统。4原理
通过接触、口服或注射对试验动物致毒后，在短时间内观察动物所产生的毒性反应，包括致死的和非致死的指标参数，通常用半数致死浓度（LCs)或半数致死剂量（LIDu)来衰示。5试验动物
5.1试验动物的选择
5.1.1选择对受试物敏感的试验水产动物选取不同分类地位、不同食性及不同养殖环境下的种以上水产动物各10尾逃行意性毒性试验预试验，筛选其中对受试物缴感的1种水产动物作为试验动物，对于预试验中求不出LCs和LDse的受试物，可以选湃其中任何1种水产动物作为试验动物。5.1.2试验水产动物选用种质纯正、规格整齐、体格键康的同批苗种，正式试验前应有7d～15d的斯荞期。
5.2试验水产动物的饲养管理
试验开始前24h停止投喂，用于接触致幸试验的水产动物在试验期间停止投饵，用于口服及注射试验水产动智正常投喝。
6操作步骤
6.1接触致毒试验
6.1.1制备受试物储备液
配制受试物储备液所用试剂至少为分析纯域给定已知浓度产品，所用水应符分GB/T6682中三级水的规定。将已知最的受试物溶于一定体积的水中。储备液应当天配制，对于化学性质较稳定的赖质，可配刷供2d以上使用的溶液,配好后0℃～4℃保有。对于那些难溶于本的物通，可采用适当的方法使其溶解或乳化，如使用超声被、有机溶剂、乳化剂等。有机溶剂在试验溶液中的浓度不应超过2
0. 1 mg/L.
6. 1.2试验溶液的配制
向水中测人适当的受试物储备液，使达到所需要的浓度。6.1,3试验求产动物分组操作
GB/T 22487--2008
迅速将试验水产动物转移到配制好的不同受试物浓度的养殖容器中，前后不应超过30min。6.2口服及注射致毒试验
6.2.1受试物的处理
受试物应落解或总浮于适宜的介质中。一-般采用水或食用植物油作介质，可以考虑用羧甲基纤维素、明胶、淀粉等配成混总液，不能配制成混悬液时，可配制成其他形式（如糊状物等）。6.2.2受试物的给予
各剂量维的口服或注射容量婴相同（niL/kg体重）。常用注射容量为10mL/k体重。-般-饮性给予受试物，也可-·日内多次给予（每次间隔4h6h，24h内不超过3次，合并作为一次剂量计算）。将受试物用于口服的方式可采用自主摄食或人工灌服；而注射的方式可采用腹腔或肌肉注射；将试验水产动物离水进行灌服或注射操作时一定要使用麻醉剂见附录A)。7试验条件
7.1试验系统
在接触致毒试验中可采用静水式试验，换水式试验或流水式试验，同时保持受试物在水中浓度的稳定性，并要保证水质指标符合GB11607的规定，必要时可以采取气泵增氧措施。口服或注射致率试验中可根据试验情况采用静水养殖系统或流水养殖系统。7.2试验容器
限据受试物性质，针对性地选择无毒，对受试物吸附性能低的材料制成的容器。受试物为重金属离子时使用由案乙烯制成的容器；受试物为有机化合物时使用玻璃、玻璃钢容器或糖瓷容器。7.3试验水温
进行急性毒性试验期间，葬殖系统水体温度要保持在试验水产动物生长的适宜温度范围内并相对恒定，水溫温差小于士2，
7.4试验周期
7. 4. 1接触致毒试验期为 24 h,48 h或 96 h,可以观察得出 24 h、48 h 及 96 b的 1.Cs0。7.4.2口服或注射致毒试验期为7d~14d,根据试验水产动物的死亡情况，得出LDso8几种常用的急性毒性试验设计方法8.1寇氏(Korbor)法
8.1.1预试验
除另有要求外，应在预试验中求得动物全死亡或90%以上死亡的剂量和动物不死亡或10%以下死亡的剂量，分别作为正式试验的最高与最低剂量。8.1.2动物数
除另有要求外，设5个～10个剂量组，每组不少于6个重复，每个重复至少30个个体。8. 1. 3剂
将由预试验得出的最高、最低剂量换算为常用对数，然后将最高、最低剂量的对数差按所需要的组数，分为几个对数等距（或不等距）的剂量组，应设计空白对照组。8.1.4试验结果的计算与统计
8,1.4.1列试验数据及其计算表
包括各组剂量（mg/k体重/k体重），剂量对数（X）动物数（n），动物死亡数（），动物死亡百分3
GB/T22487-2008
比(P,以小数表示),相邻剂量比值的对数(a)，以及统计公式要求的其他计算数据项目：8.1.4.2LD的计算公式
模据试验条件及试验结果，可分别选用下列兰个公式中的个，求出1gLD。，再查反对数表，求得LDksa(mg/kg体重,g/kg体重)。
8.1.4.2.1按本试验设讨得出的任何结果，均可用式(1)计算出1gLDs3。(X.+X+)-(P-P.)
lgLDs。 = Z -
式中：
X..X1相邻两组的剂量对数。
P+1,P.和邻两组的动物死亡百分比。8.1.4.2.2按本试验设计且各组间剂量对数等距时，可用式(2)计算出1gLDs0(Pr-P)
IgI.Do = XK -
XK一-最高剂量对数，其他同式(。-(1
8.1.4.2.3当试验条件同8.1.4.2.2丑最高、最低剂量组动物死亡百分比以小数表示）分别为1全死)和0（全不死时），则可用便于计算的式（3）。IgLD = XK —d(EP- 0. 5)
式中：
P—备组动物死亡百分比之和，其他同式（2)。8. 1. 4. 3标准误差与 95%可信限8.1.4.3.1gLD的标准误差(S)计算见式(4)。Siauieo
8. 1.4. 3.295%m信限(X)的计算见式(5)。VSPi-PS
X = Ig~(IgLDu ± 1. 96Stgrng）-(3)
此法易于理解，计算简便，可信限不大，结果可靠，特别是在试验前对受试物的急性毒性程度了解不多时,元为适用。
8.2机率单位-对数图解法
8. 2. 1预试验
以每组3个个体至5个个体我出全死和全不死的剂基。8.2.2动物数
除另有要求外，每组不少于6个重复，每个重复至少30个个体，8.2.3剂量及分组
在预试验中得到的两个剂量组之间拟出等比的六个剂量组或更多的组。此法不要求剂量组间呈等比关系，但等比可使各点矩离相等，有利于作图，应设计空白对照组，8,2. 4 作图计算
8.2.4.1将各组按剂量及死亡百分率，在对数概率纸上或计算机作图。除死亡百分率为0及100%者外，也可将剂量化成对数，并将百分率查概率单位表得其相应的概率单位作点于普通算术格纸上，0及100为死亡率在理论上不存在,为计算需要：为0. 25×100%,10%改为IN-%.252×100%。D为
其中，N为该组动物数，相当于0及100%的作图用概率单位。8.2.4.2划出直线,以透明尺目测，并照顾概率。8.2.5计算标准误差
标准误差的计算见式(6)。
SE=2S//2N
式中：
SE-—标准误差；
2S—LD与 LD之差,即 2S = LDgL.D(或 EDy—EDre)GB/T22487—2008
N——概率单位3.5-~6.5之间反应百分率为6.7~93.7之间)务组动物数之和。相当于I.D4及LD1的剂量均可从所作直线上我到。也可用普通方格纸或计算机作图，查表将剂量换算成对数值，将死亡率换算成概率单位，方格纸模坐标为剂量对数，纵坐标为概率单位，根据剂量对数及概率单位作点连成线，山概率单位5处作一·水平线与直线相交，由相交点向横坐标作一垂直线，在横坐标上的相交点即为剂量对数值,求反对数致死量(LD)值。8.3最大耐受剂量法
8.3.1适宜条件，毒性极小的或末显示毒性的受试物，给子动物最大使用浓度和载大口服及射容量时，仍不出现死亡。
8.3.2动物数：除另有要求外，每组不少于6个重复，每个重复至少30个个体。8.3.3剂量：受试物最大使用涨度和口服及往射体积(一个剂量组）。8.3.4方法试验水产动物在试验前器在相厕试验条件下耻养、观察7d，试验前一天停止暇食，试验时给予最人使用浓度或最大口服及注射容量的受试物1内1次或多次给，1d内最多不超过3次），连续观察7d~14d，动物不出现死亡，则认为受试物对某种动物的急性毒性最人耐受剂量大于某--数值(mg/L或g/kg体重）。最大口服及往射容量为20mL/kg体重。9中违反应观察
给予受试物后，即观察并记录试验水产动物的中声表现(如丧失平衡)和死亡情况，包括出现的塞度与时间。对死亡动物进行解部。10结果评价
根据LC或LDs数值，判定受试物的性分级。由中表现初步提示作用特征。急性毒性(LDso)剂量分级表见附录B。
GB/T 224B7-—2008
名称和化学式
兰卡函
附录A
（规范性附录）
急性毒性(LD)实验中常用麻醉剂及使用剂量表A.1急性毒性(L1D)实验中常用麻醉剂及使用剂量表别名
鱼保安
Tricaine Methanesulphanatc
C,HisNO,S
丁香酚
Eugepl
2-甲氧-4 内烯基酚
三般效丁醇
Ghlorceutanol
CH,CO0.5HO
Finguelrx
AQUI-S
白色微细结晶粉未，
吞于水
可直接分散于海水和谈承中，
无需级冲液
白色微细结晶粉末，
易溶于有机落剂
使用铱度
25 mg/L~
300 mg/1.
25mR/L~
100g/L
100 mg/1.--
1 2n3 mg/L
作用时间
1 min--3 min
4 s-- min
20 s~1 min
中等寿
实际无
附录B
(规范性附录）
急性毒性剂量分级
表 B.1急性毒性游量分级表
水产动物接触致考
LCsp/(rng/L)
1a0--l coo
10c0~10005
>10 0c0
GB/T 22487—2008
水产动物口服及注射致毒
LDse/tmg/kg)
1~·50
51~500
501--5 000
5 001~15 000
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