【国家标准(GB)】 日本乙型脑炎病毒反转录聚合酶链反应试验方法

ICS11.220
中华人民共和国国家标准
GB/T22333—2008
白本乙型脑炎病毒
反转录聚合酶链反应试验方法
Reverse transcription polymerase chain reaction forJapanese B encephalitis virus2008-08-22发布
中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中国国家标准化管理委员会
2008-12-01实施
本标准的附录A为规范性附录。
本标推出中华人民共和国农业部提出。前
本标推由全国动物防疫标准化技术委员会归口。本标准起草单位：农业部兽医诊断中心言
本标推主要起草人：下宏伟、孙明、王传彬、陈西、田克恭。合品伙伴网http：
rarfoc
GB/T 22333—2008
1范围
且本乙型脑炎病毒
反转录聚合酶链反应试验方法
本标准规定了日本乙型脑炎癫酶核酸的反转录聚合酶链度应试验的技术要求。本标准适用于动物脑组织年日本艺型脑病静核的检测。试剂
变性液(见第 A
2 mol/I. 乙酸霸降
武pH4
酚-三氯甲烷
8 mmol/L上
2.610倍PC
1%濞化，
TAE电池
戊尊混合
游引物混
ER)溶液。
2.91%琼脂
2.10上样缓配第A.4
2. 11 其他试:10U/μL AMwww.bzxz.net
U/μLTaeD合酶、异丙
蒸水，
3实验率条件
实验室级别要
实验案必须为生
3.2实验室分区
前见第A
CB/T22333--2008
标推物、5U/LRNA酶抑制剂、
醇溶液、25
级（BSL-3级）实验室，
化镁溶液DE处理过的无菌双
RT-PCR试验区域分反液配制区（配液区）、核酸提聪区、扩增区电泳区。流程顺序为配液区-核酸提墩区→扩增区->电泳区。严禁器材和武剂街。3.3实验案应配备的仪器及耗材
3.3.1仪器：分析天平、高速离心机、真空干媒鑫、PCR扩增仪、电泳仪、电泳槽、紫外凝胶成像仪（或紫外分析仪）、波氮罐或一70℃冰箱、微波炉、组织研磨器、一20C冰箱、水济锅、可调移液器（最大量程分别为2μL20μL2a0g,1000L)
3.3.2耗材：眼科剪、眼科镊、称昼纸、10 mL 一次性注射器、1.5mL灭菌离心管、0.2mL薄壁 PCR管、琼脂糖、500mL量筒、500mL锥形瓶、吸头（10μL、200μL、1000zL）、灭菌双蒸水。4
操作程序
4.1样品的采集及处理
4.1.1样品的采集：濑死动物、扑杀动物或流产胎儿取脑组织。样品的处理：每份样品分别处理。4. 1.2
合日纯体网
GB/T22333—2008
4. 1.2.1 组织样品处理,取待检脑组织病料约 0. 05 置研磨器中剪碎并研磨,加入 400 μL 变性液继续研磨。取凹研磨好的待检病料[清200pL，置1.5mL灭菌离心管中，加人200L变性液，混匀4.1.2.2阳性对照处理：取Ⅱ本乙型脑炎病毒弱疫苗200zL，置1.5ml.灭菌离心管中，加人200μL变性液，混匀。
4.1.2.3阴性对照处现：取健康猪血清200μL，置1.5mL灭菌离心管中，加人200uL变性液混匀。4.2病毒RNA的提取
4.2.1取已处现的待捡样品及阴性、阳性对服样品，每管依次加入乙酸钠溶液30L、酚-三氯甲烷-异戊醇混合液300mL，颠倒10次混句，冰溶15min，4℃13000g离心15min4.2.2取上消300μL置于新的经DEPC水处理过的1.5mL灭菌离心管中，加入等体积异丙醇，混,置液氮中3min或一70 C冰箱中30 min。取山样品管,室温融化,将离心开口侧朝离心机转轴方向放人离心机内，4℃20000g离心20min。4.2.3奔上清，沿离心管开口方向笃壁缓缓滴人一20℃预冷的75%艺醇1mL，轻轻旋转洗一次后倒掉,将离心管倒扣于吸水纸上 1 min，真垒抽下 15 min.4.2. 4用 1D μ1. 尤 RNA 酶的灭菌双蒸水和 1 μL RNA酶抑制剂沿离心管开口侧相反方向溶解沉凝,一20C储存备用，
4.3RT-PCR反应液组成（总体积25uL)DEPC水
2. 3 mmol/L dNTF
8mmol/L上下游引物混合液
25mmol/L氛化镁裕液
10倍PCR缓冲液
AMV反转录酶
RNA酶抑制剂
5 U/μL Tag DNA聚合酶
提取的RNA
4.4RT-PCR反应程序
2. 5 μl.
42℃45min，95℃3min扩增条件为95℃808，50C40s，7240$，35个循环后，72慈伸10 min。
4.5电泳
将PCR扩增产物15μL与3μL上样缓冲液混合，加样于1%琼脂糖凝胶孔中，琼脂糖凝胶板-侧点样孔加人100bpDVA分子质最标准物，以5V/cm电压电泳40min，用紫外胶成像仪观察结果。5结果判定
当阳性对照山现375bp扩增带，阴性对照未出现目的带时，实验结果成立。被检样品出现375bp扩增带为日本乙型脑炎病毒阳性，末出现相应扩增带的样品判为阴性。2
变性液
柠檬酸钠
十三烷基肌氨酸钠
3-巯基乙醇
异硫氰酸胍
灭菌双蒸水
0.868 ml.
(规范性附录）
试剂的配制
加至 100 mL
酚-三氯甲烷-异戊醇混合液
酸性酚
三氯甲烧
异戊醇
引物序列
上游引物 P5'-CAT TCC AAG CGA AGCAGG AGA TCC-3'下游物P,，5'-GACGTCCAATGTTGGTTTGTCG-3上样缓冲液
GB/T22333-2008
漠酚蓝0.2g，加双蒸水10mL过夜溶解。50g薰糖加人50ml水溶解后，移入已溶解的漠酚蓝溶液中，勾定容至100mL
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