【国家标准(GB)】 鸭病毒性肠炎诊断技术

ICS 11.220
中华人民共和国国家标准
GB/T22332-—2008
鸭病毒性肠炎诊断技术
Diagnostic techniques for duck vires enteritis2008-08-22发布
中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中国国家标准化管理委
2008-12-01实施
GB/T22332—2008
本标准部分技术采用OIE《陆生动物诊断试验和疫苗手册（2004)推荐的试验方法，并把其体操作程序予以细化。
本标准由中华人民共和国农业部提出。本标准由全国动物防疫标准化技术委员会归口。本标准起草单位：华南农业大学、中华人民共和国广东出人境检验检疫局。本标谁主要起草人：郭霄峰、鹰明、洪洁心。伴区
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1范围
鸭病毒性肠炎诊断技术
GB/T22332—2008
本标准规定了鸭病毒性肠炎病毒（DVEV)分离和鉴定及聚含酶链式反应（PCR)试验的诊断技术要求。
本标准适用于鸭病毒性脑激的诊断。临床症状和病理变化
家养的鸭和雏鸭
现象，产蛋量期显下
至成年均可感染发病。在易感鸭群，初舱症状带为突发持续性高死亡于魔塑
(DVE)后临床症检病变有
水样腹泻和流鼻
弱、精神沉郁。
检时发理
特征性大体病型
坏，巴样器官
伤，消化道上皮
3病毒分离
常病鸭羽
7周龄bZxz.net
景的鸣并不
管受损，带
实质器官室
出现嗜酸性
3. 1 材科准备
3.1.1病料的采
等组织样品。活
素，1000ug链霉素
水中。
設麻在感
的棉我
低，真
成熟的公鸣的
甜脑浆内包油
齿毒数的不回，暴发鸭病毒性肠炎、柏光烦海缺乏食欲、共济失调、翘胺支撑方能器持平衡，整个外观本重下降，呈虚色，肛门染有血迹。垂。性成热丹意的卵桌然泡出血。道粘膜表面有环状出血和白喉样损的特征性病整是险管及内脏器宫损活育采壤。
谢死期食采集肝、鹿、恼
武子放家每毫群含有1000IU青掌检病应器
手50%的甘油生现盐
3.1.2病料的保存，采集样品若在48h内处理，可于4℃保存；侧应激贮存最好）。
20以下保存（-70
3. 1.3病料的处理;将棉拭与实分抢动接于后除去球样品被经感 000 z/min 4C高心30 min,取上清液作为接种材料。组织样品究摄pH7.2～7.6的PBS制感孕梧～10倍乳剂，3000r/min4℃离心30min，取上清液作为接种材料。为防正细菌染，虹在样品液中加人肯获素（1000IU/mL），链舞素（1000μg/mI)，卡那霉袭（1000μg/mL),37C温箱中作用30 nin。进行无菌检验。3.1.4鸭胚：10R~11日龄的非DVE疫苗免疫鸭胚。3.2实验操作
3.2.1胚胎接种：取经处理并且无菌检验合格的样品，以0.2L/胚的量经绒毛尿囊膜接种10日~11日龄的非DVE疫苗免疫的鸭胚，个样品接种4个~5个胚，于38C～38.5℃恒溢箱中孵育：72h前每天照胚1次~2次，以后每天照胚5次。弃去72h前死1的胚胎，冻存72h～12h内的死胚或活胚。
3.2.2病毒收获：无菌收收72h~120h内的死胚或活胚的绒毛尿囊膜和尿囊液，-20它保存备用。3.2.3如第一代分离结果为阴性，需言传三代。GB/T 22332—2008
4.1引物
P1:GAG CGT ATT TAG TAG AAA CTG CL游)P2:TGAATGTTGTGATTGTTC(下游)
4.2病毒核酸的抽提
4. 2. 1组织样品用 pH7. 2~7. 6 的 PBS制成5倍~10 倍乳剂:3 000 r/min 4℃离心 30 min,上消液作为待检材料
4. 2. 2 取一支 1. 5 mL 的指形管,加入 400 μL 待检胚液或 4. 2. 1 上清液和 30 μL(20 tmg/ mL)核糖核酸酶，混匀后，室温下作用20 tmin，4.2.3加43 μL 10%的十二烷湛磺酸钠溶液和 5μL(10 mg/mL)鲨白酶K,42 ℃水浴温育过夜。4.2. 4 等量的 Tris-盐酸饱和酚(pH7. 6),充分混勾,12 000 r/min 离心 5 mit,小心吸出上层水相于另一个指形管中，
4.2.5加等量的酚-三氯甲烷-异戊醇（25：24：1)，充分混勺，12000r/min离心5min，小心吸出上层水柑于男个指形管中。
4.2.6加1/10 体积3 mol/L 的乙酸钠（pH5.4),2.5倍体积预冷的无水乙醇,15 C00 r/min 离心20 min,弃去乙醇,沉淀用 75%的乙醇洗涤-次,真室下燥。用 20 μI 灭菌双蒸水溶解沉淀，一20 ℃保存备用。
4.3操作程序
取一支 0.5 mL 的指形管，依次入下列试剂:2. 5 uI 10×的PCR缓冲液，1. 0 u.上游引物，1. 0 μL下游引物,0. 5 μL dNTP,1. 0 μL病毒核酸,18. 5 μL 灭菌双蒸水,0. 5 μJ Tuq DNA 酶 于 PCR仪中运行：94℃30$，55℃30s，72℃30$.25个循环，728min，同时设立阳性和阴性对照，4. 4PCR 产物的检测
反应结束后,PCR 产物于 1,2%的琼脂糖凝胶中电泳,链个样品的加样量为 5 L～10 μL,同时以100bpDNA分子质量标准物为参照。50V恒压电泳40min，丁紫外灯下观察。4.5结果的判定
阳性对照在416bp处有一条特异的DNA条带，阴性对照没有目的带，证明本实验成立，待检样品在相同位置有DNA粥,判为阳性，否则为阴性。2
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