【国家标准(GB)】 动物源性食品中链霉素残留量测定方法酶联免疫法

ICS67.050
中华人民共和国国家标准
GB/T21330—2007
动物源性食品中链霉素残留量测定方法酶联免疫法
Method for the determination of streptomycin residues in aminal original foodEnzyme-linked immunosorbent assay2007-10-31发布
中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中国国家标准化管理委员会
数码防伤
2008-04-01实施
本标准的附录A,附录B为资料性附录。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国浙江出人境检验检疫局本标准主要起草人：施伟良、张晓峰、朱振江、黎昊雁、吴娜。本标准系首次发布的国家标准。ikAoNiiKAca
GB/T21330—2007
1范围
动物源性食品中链霉素残留量测定方法酶联免疫法
GB/T21330—2007
本标准规定了肉类、内脏、水产品，牛奶和奶粉中链霉素残留量的酶联免疫测定方法。本标准适用于肉类、内脏、水产品、牛奶和奶粉中链霉素残留量的测定本标准的方法检出下限：肉类、内脏和水产品为50.0ug/kg：牛奶和奶粉为20.0μg/kg2规范性引用文件
下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注明日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注明日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GB/T6379（所有部分）测量方法与结果的准确度（正确度与精密度）GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法（GB/T6682—1992，negISO3696：1987）3原理
微孔板中包被有绵羊抗兔IgG抗体，加入特异性抗体（免抗链霉素抗体）、酶标记链霉素、链霉素标准品或样品提取液后，得异性抗体与包被的绵羊抗免IgG抗体结合，同时游离链霉素和酶标记链等素竞争性的与特异性抗体结合：通过洗涤除去未结合的链霉素和酶标记链霉素，然后加入底物显色，用酶标仪测定吸光度，根据吸光度值得出试样中链需素的含量。4试剂和材料
除去另外说明外，所有试剂均为分析纯，水为GB/T6682规定的一级水。4.1链霉素检测试剂盒（组成参见附录A)。三氮乙酸。
4.3氯化钠。
4.4氯化钾。
磷酸二氢钾。
磷酸氢二钠。
磷酸二氢钠。
吐温-80。
4.93%三氯乙酸：称取3g三氯乙酸（4.2），用水定容至100mL4.10PBS缓冲液：8.5g氯化钠，1.15g磷酸氢二钠，0.27g磷酸二氢钠，用水定容至1L。SDB级冲液：1.15g磷酸氢二钠，0.2g磷酸二氢钾，0.2g氯化钾，30g氯化钠，0.5mL吐4.11
温-80，用水定容至1L
4.12正已烷。
4.13链霉素标准物质：纯度大于等于98%。4.14链霉素标准品溶液的配制：用灭菌水作为溶剂配制成25mg/mL的储存液，于一20℃条件下保存。
GB/T21330—2007
5仪器
5.1酶标仪。
5.28道移液器：50u~300μl。
5.3单道移液器：5uL~50μL，100gL~1000μL和2ml.~10ml.。5.4混合振荡器。
5.5离心机：
具塞试管：20mL、50mL。
试样的制备与保存
6.1试样的制备
-KANiKAca-
对组织样品：从全部样
等代表性样品，混匀，用四分法缩分出不小于1000g试样，去除脂肪、充分绞碎、混勾、分装离并加以标识。对牛奶和奶粉：从原婚包麦中取有代表性样品清洁密闭容器，加封后
标明标记。
6.2试样的保存
将样品于—18
分析步骤
7.1提取
7.1.1组织
20℃条件下保存
称取2.5g去
高均质样品，精确到
振荡10min，加人
10mL的3%三氯乙酸
分混句，用四分法缩分出不小于500试样，装人分
1g，置于50ml具塞试管中，加入5mLPBS缓冲液（4.10）0002/m
9）涡旋10min.6
min。取3mL上清液
nin离心15
于干净试管中，再加
3mL正已烧（4.12）
的SDB(4.11)缓冲
液钢节pH至
7.1.2牛奶
牛奶样品先离心专品航
5左君。
000r/min离心10min
吸取150
L下层液体加950L
最后稀释倍数为50
SDB缓冲液
然后以
质量相等的水进行稀释
右，最后稀释倍数为10。
7.2测定条件
7.2.1酶标仪测定条件
11)直接做10倍稀释，对于奶精则可以先用与样品离心去脂，然后再以SD缓冲液（4.做5倍稀释，调节pH至7.5左to
酶标仪测定波长为450nm
7.2.2洗板条件
7.2.2.1人工洗涤次数5次以上，每次注水量为250ul，7.2.2.2自动洗板可以预定5次周期。7.2.3操作条件
所有操作应在室温下（20℃24℃）进行，链霉素试剂盒中所有试剂的温度均应回升至室温（20℃~24℃）后方可使用。
7.3测定步骤
7.3.1将测定需用的微孔板备齐并插人微孔架上，记录标准品及样品等在微孔架上的位置。1）给出该信息是为了方便本标准的使用者，并不表示对某一产品操作步骤的认可。如果其他产品的操作步骤有不同，需经实验评估后采用。
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7.3.2吸取100uL零浓度标准品于孔A1、A2；并吸取50L零浓度标准品于孔B1、B2：分别吸取50L链霉素标准溶液（浓度分别为：0.25、0.5、1.0、2.0.10.0、20.0ng/mL)于孔C.C12-H1、H2；吸取50μL样品溶液于其余微孔中。7.3.3分别吸取25μL链霉素酶标记物溶液于除A1、A2外的每一个微孔。7.3.4分别吸取25μL链需素抗体溶液于除A1、A2外的每一个微孔。7.3.5用封口膜封孔条，并持微孔板在台面上以圆周运动方式混。7.3.6将酶标板置于4℃避光孵育1h，7.3.7倒出孔中的液体，将微孔架反扣在吸水纸上反复拍打，以除去孔中过多的残液，但不能使微孔干燥。再立即用洗涤缓冲液按7.2.2条件进行洗板。要注意不能使微孔干燥。7.3.8迅速加人100L底物容液于每一个微孔底部持微孔板在台面上以圆周运动方式混匀后，于20℃~24℃避光孵育30m
7.3.9迅速加人100
应正液于每一个微孔，持微孔板在合面上以圆周运动方式混后，将微孔还测量吸光度（加人反应终止液后应在30min内读取吸光度）。架置于酶标仪中，在
注：测定中吸取不百#和样品密液时应更换7.4平行试验
按以上步骤
7.5空白试验
标准溶液、同一样品溶波均应进行平行试验测定。除不称取试样外均按上述步骤选行S
7.6监控试验
每次测定士
8结果计算
一个添加链每素标准（4.14）
的样品，添加浓度为相应产品的最高残留限量。从含有标准品和样品的板孔的吸光度（O）值中，减去）空白孔A1、A2的平均QD值。标准品和样品的OD平均值
标准（B1
OD值为最大吸光
的百分数bzxz.net
B2）的平均OD值，再乘！
零标准为100%（量大吸光度值），其他在半对数坐材以吸光度值为纵坐标(%）链需紧标准落液浓度（n/mL为横坐标，绘制标准工作曲线。从标准一还线上得到试样中相应的果按式）进行计算：
内罐霉素浓度居，结！
式中：
mx1000
样品中链霉素的残量，单位为微克每千克（ug/kg）从标准工作曲线上得到的样品中链露素浓度单位为纳克等毫升（ng/mL)；样品溶液的最终定容体和积，单位为毫升（mL）；样品溶液所代表的最终试样质量单位为克（注：也可以用各种酶标仪的数据处理软件进行计算。所得结果表示至一位小数。9确证试验
如被测样品中链素残留量的值大于限量要求时，应用其他方法进行确证。回收率参见附录B，
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A.1预包被抗体的96孔板：12条×8孔附录A
（资料性附录）
链需素试剂盒23
iKANKAca
链霉素标准溶液：0、0.25.0.5、1.0、2.0、10.020.0ng/mLA.2
A，3链霉素酶标记物冻干粉：根据链霉素试剂盒中说明，可用稀释缓冲液配制成链霉素酶标记物溶液。
A.4抗链素抗体冻干粉：根据链霉素试剂盒中说明，可用稀释缓冲液配制成抗链霉素抗体溶液。A.5底物TMB溶液。
A.6稀释缓冲液：根据链霉素试剂盒中说明，可用水配制成洗涤缓冲液。A.7洗涤浓缩液（10倍浓缩）：可用水稀释后使用。A.8反应终止液。
注：试剂盒应在4℃~8℃避光条件下保存，落解后的酶标记物和抗体溶液需在一15℃条件下冻存。2）给出该信息是为了方便本标准的使用者，并不表示对某一产品的认可。如果其他产品具有相同的效果，需经实验评估后使用这些等效产品。
附录B
（资料性附录）
回收率
本方法中链需素添加浓度及回收率的试验数据：a）组织样品（包括水产品）：
添加量为50uμg/kg时，平均回收率为85.9%~96.3%；添加量为500μg/kg时，平均回收率为87.7%~92.7%；添加量为1000μg/kg时，平均回收率为88.7%~92.1%。b）牛奶样品：
添加量为20ug/kg时：平均回收率为89.4%；添加量为200ug/kg时，平均回收率为92.6%；添加量为1000μg/kg时，平均回收率为90.3%。GB/T21330—2007
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