【国家标准(GB)】 动物源性食品中庆大霉素残留量测定方法酶联免疫法

ICS67.050
中华人民共和国国家标准
GB/T21329—2007
动物源性食品中庆大霉素残留量测定方法
酶联免疫法
Method for the determination of gentamicin residues in animaloriginal food-Enzyme-linked immunosorbent assay2007-10-31发布
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中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中国国家标准化管理委员会
2008-04-01实施
本标准的附录A、附录B为资料性附录。前言
本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国浙江出入境检验检疫局。本标准主要起草人：施伟良、张晓峰、方莹、谢文、朱振江。本标准系首次发布的国家标准。GB/T21329—2007
1范围
动物源性食品中庆大素残留量
测定方法酶联免疫法
GB/T21329—2007
本标准规定了肉类、内脏、水产品、牛奶和奶粉中庆大霉素残留量的酶联免疫测定方法。本标准适用于肉类、内脏、水产品、牛奶和奶粉中庆大霉素残留量的测定。本标准的方法检出下限：肉类和水产品为10.0ug/kg：内脏、牛奶和奶粉中为20.0ug/kg：2规范性引用文件
下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款，凡是注明日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注明日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GB/T6379（所有部分）测量方法与结果的准确度（正确度与精密度）GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法（GB/T6682—1992，neqISO3696：1987）3原理
微孔板中包被有绵羊抗免IgG抗体，加人特异性抗体（兔抗庆大舞素抗体）、酶标记庆大需素、庆大霉素标准品或样品后，特异性抗体与包被的绵羊抗免IgG抗体结合：同时游离庆大霉素和酶标记庆大霉素竞争性的与特异性抗体结合。通过洗涤除去末结合的庆大需素和酶标记庆大荐素，然后加人底物显色，用酶标仪测定吸光度，根据吸光度值得出试样中庆大霉素的含量。4试剂和材料
除去另外说明外，所有试剂均为分析纯，水为GB/T6682规定的一级水。4.1庆大霉素检测试剂盒（组成参见附录A)。4.2三氯乙酸。bzxz.net
4.3氯化钠。
4.4氯化钾。
磷酸二氢钾。
磷酸氢二钠。
磷酸二氢钠。
吐温-80。
3%三氯乙酸：称取3g三氯乙酸（4.2），用水定容至100mLPBS缓冲液：8.5g氯化钠，1.15g磷酸氢二钠，0.27g磷酸二钠，用水定容至1L，4.10
4.11SDB缓冲液：1.15g磷酸氢二钠，0.2g磷酸二氢钾，0.2g氯化钾，30g氯化钠，0.5mL吐温-80，用水定容至1L，
4.12正已烷。
4.13庆大霉素标准品为USP级。
4.14庆大霉素标准品溶液的配制：用灭菌水作为溶剂配制成50mg/mL的储存液，于一20℃条件下保存。
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5仪器
酶标仪。
5.2八道移液器：50μL~~300μL。5.3单道移液器：5L~50μl,100μL~1000μL和2mL~10mL5.4混合振荡器。
离心机。
具塞试管：20mL50mL
试样的制备与保存
6.1试样的制备
对组织样品：从全部样品有代表性样品，混匀，用四分法缩分出不小于1000g试样，去除脂并加以标识。
肪、充分绞碎、混均、分装、
对牛奶和奶粉：从原有麦中取有代表性样标明标记。
清洁密闭容器，加封质
6.2试样的保存
将样品于-18
分析步骤
7.1提取
7.1.1组织
20℃条件下保存
称取2.5g去
方均质样品，精确到
分混勾，用四分法缩出不小于500g试样，装人g.置于50ml
试管中，加入5LPES缓冲液（4.10）具
(4.9）涡施10min，6000z/nin离心15min。取3mL上清液振荡10min，加入10mL的3%三氯艺酸mL正已烧（412）提合：30001/min离心于一干净试管，再加
0min，吸取15dul，下层液体加
350μL的SDB(4.1
7.1.2牛奶
液，调节
6PH至75
右。最后稀释倍数为20，
牛奶样品先离心卡胎肪，然后以SDB级冲液（质量相等的水进行稀科汽
右，最后稀释倍数为10
7.2测定条件
7.2.1酶标仪测定条件
酶标仪测定波长为450nm
7.2.2洗板条件
·然后再以
7.2.2.1人工洗涤次数5次以上，每次注水量为7.2.2.2自动洗板可以预定5次周期。7.2.3操作条件
）直接做10倍稀释；对于奶精则可以先用与样品DB缓冲液（4.11）做5倍稀，调节pH至7.5左所有操作应在室温下（20℃～24℃）进行，庆大霉素试剂盒中所有试剂的温度均应回升至室温（20℃~24℃）后方可使用。
7.3测定步骤
7.3.1将测定需用的微孔板备齐并插入微孔架上，记录标准品及样品等在微孔架上的位置。1）给出该信息是为了方便本标准的使用者，并不表示对某一产品操作步骤的认可。如果其他产品的操作步骤有不同，需经实验评估后采用。
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7.3.2吸取100L零浓度标准品于孔A1、A2：并吸取50μL零浓度标准品于孔B1、B2；分别吸50μL庆大霉素标准溶液(0.25、0.5.1.0、2.0、10.0、50.0ng/mL）于C1.C2H1、H2；吸取50μL样品溶液于其余微孔中。
7.3.3分别吸取25μL庆大霉素酶标记物溶液于除A1、A2外的每一个微孔。7.3.4分别吸取25μL庆大霉素抗体溶液于除A1、A2外的每一个微孔。7.3.5用封口膜封孔条，并持微孔板在台面上以圆周运动方式混匀。7.3.6将酶标板置于4℃避光孵育1h7.3.7倒出孔中的液体，将微孔架反扣在吸水纸上反复拍打，以除去孔中过多的残液，但不能使微孔于燥。再立即用洗涤缓冲液按7.2.2条件进行洗板，要注意不能使微孔干燥。7.3.8迅速加100μL底物溶液于每一个孔底部特微孔板在台面上以圆周运动方式混匀后，于20℃~~24℃避光孵育30mm
7.3.9迅速加入100
成多止液于每一个微孔。持微孔板在台面上以圆周运动方式混匀后，将微45处测量吸光度（加入反应终止液后应在30min内读取吸光度）。孔架置于酶标仪中，在
注：测定中吸取不同动影剂和样品落液时应更换吸7.4平行试验
按以上步骤
7.5空白试验
标准浴液、同一样品落液均应进行平行试验测定。均按上述步聚进行
除不称取诗
6监控试验
每次测定地
结果计算
一个添加庆大舞案标准（4
的样品
从含有标准品和样品的板孔的吸光度（OD）值中品的OD平均值院
零标准（B1
OD值为最大吸
的百分数
1B32）的平
空白孔A1、A2的平均（D值。标准品和样减去
OD值，再乘顾
零标准为10%（量大吸光度值），其他以吸光
在半对数坐标
度值为纵坐标（%）庆大霉素标准浴液浓度g/I为横坐标，绘制标准工作曲线。从标准文医
结果按式(1)进行计算：
线上得
到试样中相应的庆大素浓度后
式中：
mX1000
样品中庆大需素的留量，单位为微克每千克（ug/kg）：从标准工作曲线上得到的样品中庆大需素浓度，单位为纳克每毫升（ng/mL）；样品溶液的最终定容体积，单位为毫升（mL)；样品溶液所代表的最终试样质量，单位为克（）。注：所得结果应表示至一位小数。也可以用各种酶标仪的数据处理软件进行计算。9确证试验
如被测样品中庆大霉素残留量的值大于限量要求时，应用其他方法进行确证。回收率参见附录B。
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附录A
（资料性附录）
庆大霉素试剂盒3
A.1·预包被抗体的96孔板：12条×8孔A.2庆大霉素标准溶液：0.0.25、0.5、1.0、2.0、10.0.50.0ng/mL。A.3庆大需素酶标记物冻干粉：根据庆大霉素试剂盒中说明，可用稀释缓冲液配制成庆大霉素酶标记物溶液。
A.4抗庆大霉素抗体冻干粉：根据庆大霉素试剂盒中说明，可用稀释缓冲液配制成抗庆大霉素抗体溶液。
A.5底物TMB落液。
A.6稀释缓冲液：根据庆大霉素试剂盒中说明，可用水配制成洗涤缓冲液。A.7洗涤浓缩液（10倍浓缩）：可用水稀释后使用。A.8反应终止液
注：试剂盒应在4C～8℃避光条件下保存，溶解后的酶标记物和抗体溶液需在-15℃条件下冻存。2）给出该信息是为了方便本标准的使用者，并不表示对某一产品的认可。如果其他产品具有相同的效果，需经实验评估后使用这些等效产品。
附录B
（资料性附录）
回收率
本方法中庆大霉素添加浓度及回收率的试验数据：组织样品（包括水产品）：
添加量为10pg/kg时，平均回收率为83.9%~97.3%；添加量为50g/kg时，平均回收率为86.8%~94.8%：添加量为500pg/kg时，平均回收率为88.0%~96.5%；b）肝、肾样品：
添加量为20μg/kg时，平均回收率为90.2%~99.4%；添加量为200ug/kg时，平均回收率为93.0%~~97.4%；添加量为1000μg/kg时，平均回收率为93.0%~97.4%；c）牛奶样品：
添加量为20g/kg时，平均回收率为95.6%；添加量为200μg/kg时，平均回收率为88.2%；添加量为1000μg/kg时，平均回收率为93.7%，GB/T21329—2007
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