【地方标准】 猪圆环病毒2型与3型双重荧光定量PCR检测方法

DB33/T2269—2020
浙江省地方标准
猪圆环病毒2型与3型双重荧光定量PCR检测方法
Duplex fluorescence quantitative PCR method for the detection of porcine circovirus type 2 and type 3
2020-06-30 发布
浙江省市场监督管理局
2020-07-30 实施

前言
本标准按照GB/T 1.1-2009给出的规则起草。DB33/T2269—2020
请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本标准由浙江省农业农村厅提出。本标准由浙江省畜牧兽医和饲料标准化技术委员会归口。本标准起草单位：浙江农林大学。本标准主要起草人：宋厚辉、邵春艳、周莹珊、王晓杜、孙静、姜胜、杨永春、程昌勇、章先、杨杨、卫芳芳。

1 范围
本标准规定了猪圆环病毒2型与3型双重荧光定量PCR的检测方法，适用于猪圆环病毒2型与3型的核酸检测。

2 规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。
GB/T 6682-2008 分析实验室用水规格和试验方法

3 缩略语
下列缩略语适用于本文件。
Ct值：达到阈值的循环数（Cycle threshold）
DNA：脱氧核糖核酸（Deoxyribonucleic Acid）
PBS：磷酸盐缓冲液（Phosphate Buffer Solution）
PCR：聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction）
PCV-2：猪圆环病毒2型（Porcine Circovirus 2）
PCV-3：猪圆环病毒3型（Porcine Circovirus 3）
Taq酶：Taq DNA聚合酶（Taq DNA polymerase）

4 试剂和材料
除非另有说明，所用试剂均为分析纯：
4.1 DNAzol试剂：DNA抽提试剂，2℃～8℃保存。
4.2 无水乙醇：4℃预冷。
4.3 75%乙醇：用无水乙醇和灭菌水配制，-20℃预冷。
4.4 8mmol/L NaOH溶液：配制方法见附录A。
4.5 0.01mol/L PBS，pH 7.2：配制方法见附录A。
4.6 2X Premix HSTaq（内含PCR buffer, HSTaq, dNTPs, Mg, RNaseH等）
4.7 阳性对照：猪圆环病毒2型灭活疫苗和猪圆环病毒3型阳性克隆质粒。PCV-3目的基因（ORF2）序列见附录A。
4.8 空白对照：灭菌水。
4.9 用于荧光定量PCR的引物浓度为10$mu$mol/L，Taqman探针浓度为5$mu$mol/L，其序列分别为：
PCV-2-F：5'-TCACCTATGACCCCTATG-3'
PCV-2-R：5'-GGAAGTAATCAATAGTGGAATC-3'
PCV-2-P：5'-FAM-ACTCCTCTCGCCATACCATAACC-BHQ1-3'
PCV-3-F：5'-TGGCTCAACACATATGAC-3'
PCV-3-R：5'-ACGGACTTGTAACGAATC-3'
PCV-3-P：5'-HEX-TGCCGTAGAAGTCTGTCATTCCA-BHQ1-3'
4.10 一次性耗材：乳胶手套、1.5mL离心管、15mL离心管、荧光PCR反应管和吸头。

5 器材和设备
5.1 电热干燥箱。
5.2 高压灭菌锅。
5.3 高速台式冷冻离心机：可控温至4℃，最大离心速度可达12000r/min以上。
5.4 冷藏冰箱、超低温冰箱（-80℃）。
5.5 荧光PCR检测仪。
5.6 组织匀浆器。
5.7 移液器。
5.8 研钵。

6 实验室分区
检测实验室应有相应的生物安全设施和功能分区，包括样品处理区、核酸提取区、试剂配制区和扩增区。各功能区有专用的试剂和实验材料，不可交叉使用。

7 样品的采集与处理
7.1 采样注意事项
采样及样品前处理过程中应注意无菌操作，防止样本交叉污染。
7.2 采样工具
药匙、剪刀、镊子，经160℃干热灭菌2h。
7.3 采样方法与处理
7.3.1 内脏样品
采取病死或剖杀猪的主要脏器（淋巴结、脾脏、肺脏和肾脏）装入15mL灭菌离心管中，按1:4倍体积加入灭菌的0.01mol/L PBS。运送至实验室后，再用研钵或组织匀浆器对组织进行充分研磨混匀，反复冻融3次。在4℃条件下以3000r/min离心20min，取上清液转入1.5mL离心管中编号备用，待检。
7.3.2 血清样品
血清样品无需处理，直接用于核酸提取。
7.4 存放与运送
采集的样品密封后，采用保温壶或保温桶加冰密封，在6h～8h之内运送到实验室。采集或处理的样品在2℃~8℃条件下保存应不超过24h；需长期保存时，应放置-80℃冰箱，但应避免反复冻融（冻融不超过3次）。

8 核酸提取
8.1 一般要求
应在核酸提取区进行。
8.2 DNAzol法抽提核酸
8.2.1 取n个灭菌的1.5mL离心管，其中n为待检样品数、2管阳性对照及2管空白对照之和，对每个离心管进行编号。
8.2.2 每管加入500$mu$L DNAzol，分别加入待检样品、阳性对照和空白对照各250$mu$L，颠倒10次混匀，静置5min；于4℃，10000r/min离心10min。
8.2.3 取900$mu$L上清，置于新的1.5mL灭菌离心管中，每使用1mL DNAzol，加500$mu$L无水乙醇，颠倒混匀5次~8次，室温放置1min~3min；于4℃，5000r/min离心5min。
8.2.4 弃上清，沿管壁缓缓加入1mL 75%乙醇，颠倒混匀3次～6次，静置0.5min~1min；4℃，1000r/min离心2min。反复洗涤两次后，将离心管倒扣于吸水纸上，自然晾干（以无乙醇味为准）。
8.2.5 用5$mu$L 8mmol/L NaOH溶液溶解沉淀，于-20℃冰箱保存备用。
8.3 核酸提取等效方法
可采用核酸提取试剂盒或自动化核酸抽提仪及配套核酸抽提试剂进行核酸抽提。

9 实时荧光PCR扩增体系的配制
9.1 在试剂配制区进行。
9.1.1 设PCR反应数为n，其中n为待检样品数、2管阳性对照及2管空白对照之和。
9.1.2 应体系配制见表1。
每个样品反应体系配制表（表1）：
- 2X Premix HSTaq: 0.4$mu$L
- PCV-2-F: 0.4$mu$L
- PCV-2-R: 0.4$mu$L
- PCV-2-P: 0.8$mu$L
- PCV-3-F: 0.4$mu$L
- PCV-3-R: 0.4$mu$L
- PCV-3-P: 0.8$mu$L
- DEPC水: 4.8$mu$L
（注：以上用量基于单次反应体系计算）