【地方标准】 转基因耐除草剂大豆DAS-68416-4及其衍生品种定性检测 实时荧光PCR法

DB12/T652-2016 转基因耐除草剂大豆DAS-68416-4及其衍生品种定性检测实时荧光PCR法 发布：2016-09-27 实施：2016-11-01 发布单位：天津市市场和质量监督管理委员会 前言 本标准按照GB/T 1.1-2009的规则起草，由天津市农村工作委员会提出。本标准起草单位包括天津市农业质量标准与检测技术研究所、中国农业科学院生物技术研究所及天津市东丽区产品质量监督检验所。本标准主要起草人：兰青阔、李亮、赵新、刘雪岩、宛煜嵩、王成、陈锐、朱珠、刘娜、徐石勇。 1 范围 本标准规定了转基因耐除草剂大豆DAS-68416-4转化体特异性的定性PCR检测方法，包括术语和定义、检测方法及结果分析与表述。本标准适用于DAS-68416-4及其衍生品种，以及制品中DAS-68416-4转化体成分的定性PCR检测。 2 规范性引用文件 下列文件对于本标准的应用是必不可少的。注日期的引用文件，其标注日期版本适用；不注日期的引用文件，适用其最新版本（包括所有修改单）： - GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 - 农业部1485号公告—2010 转基因植物及其产品成分检测 DNA提取和纯化 - 农业部2031号公告—8—2013 转基因植物及其产品成分检测 大豆内标准基因定性PCR法 - NY/T 672 转基因植物及其产品检测通用要求 3 术语和定义 3.1 Lectin基因：编码大豆凝集素的基因。 3.2 DAS-68416-4转化体特异性序列：DAS-68416-4外源插入片段5端与大豆基因组的连接区序列。 4 原理 根据DAS-68416-4转化体特异性序列设计特异性引物，对试样DNA进行PCR扩增。通过实时荧光扩增曲线判断样品中是否含有DAS-68416-4转化体成分。 5 检测方法 5.1 试剂和材料 除非另有说明，仅使用分析纯试剂和重蒸馏水或符合GB/T 6682规定的一级水。 5.1.1 TaqMan荧光定量PCR反应试剂盒 5.1.2 引物和探针 - Lectin基因： - lec-1215F: 5'-GCCCTCTACTCCACCCCCA-3' - lec-1332R: 5'-GCCCATCTGCAAGCCTTTTT-3' - lec-1269P: 5'-FAM-AGCTTCGCCGCTTCCTTCAACTTCAC-BHQ1-3' 预期扩增片段118bp - DAS-68416-4转化体特异性序列： - DAS-68416-4-F: 5'-GGGCCTAACTTTTGGTGTGATG-3' - DAS-68416-4-R: 5'-TACTTGCTCTTGTCGTAAGTCAATAAATT-3' - DAS-68416-4-P: 5'-HEX-TTCAAGCACCAGTCAGCAT-MGB-3' 预期扩增片段128bp 引物和探针稀释至10 μmol/L，探针避光保存。 5.2 仪器 分析天平（感量0.1g和0.1mg）、荧光定量PCR扩增仪、核酸定量仪、重蒸馏水发生器或纯水仪及其他相关仪器设备。 5.3 分析步骤 5.3.1 抽样 按NY/T 672和农业部2031号公告—2013规定执行。 5.3.2 试样准备 按NY/T 672和农业部2031号公告—2013规定执行。 5.3.3 试样预处理 按农业部1485号公告—2010规定执行。 5.3.4 DNA模板制备 按农业部1485号公告—2010规定执行。 5.3.5 PCR反应 5.3.5.1 标准样品和试样实时荧光PCR反应 标准样品和试样的PCR反应同时进行，每个PCR反应设置3次平行。DAS-68416-4转化体实时荧光PCR反应按表1在PCR反应管中依次加入反应试剂并混匀。