【地方标准】 禽腺病毒4型PCR检测方法

ICS 11.220
B43
DB13
河北省地方标准
DB13/T2593-2017
禽腺病毒4型PCR检测方法
2017-11-22发布
2017-12-22实施
河北省质量技术监督局发布

前言
本标准按照GB/T1.1-2009规则起草，由河北农业大学提出并归口。本标准起草单位：河北农业大学。本标准主要起草人：袁万哲、王建昌、孙继国、刘聚祥、李丽敏、陈立功、李睿文、张磊、白云、陈赛娟、李杰峰。

1 范围
本标准规定了禽腺病毒4型PCR检测方法的技术要求，适用于检测家禽咽喉拭子、肛拭子、发病禽组织及这些采集样品培养物中的禽腺病毒4型。

2 术语和定义
2.1 DNA：脱氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid）。
2.2 EB：溴化乙锭（ethidium bromide）。
2.3 PCR：聚合酶链式反应（polymerase chain reaction）。
2.4 dNTP：脱氧核苷酸三磷酸（deoxyribonucleoside triphosphate）。

3 试剂或材料
包括病毒核酸提取试剂盒，1.0%琼脂糖凝胶，50×TAE缓冲液，溴化乙锭或核酸染料，DEPC处理的灭菌双蒸水，DNA分子量标准（100bp），2x Taq Master Mix或商品化一步法PCR反应试剂。使用EB操作应戴手套和口罩，污染物应进行无害化处理；DEPC操作在通风条件下进行，接触皮肤应立即冲洗。
3.1 病毒核酸提取试剂盒。
3.2 1.0%琼脂糖凝胶（配制方法见附录A.1）。
3.3 50×TAE缓冲液（附录A.2）。
3.4 EB（10 μg/μL）或核酸染料（附录A.3）。
3.5 DEPC处理的灭菌双蒸水（附录A.4）。
3.6 DNA分子量标准（100bp），包括100bp、250bp、500bp、750bp、1000bp、2000bp。
3.7 2x Taq Master Mix。
3.8 商品化一步法PCR反应试剂，包括PCR缓冲液、酶混合物、dNTP混合物及无RNA酶水。
3.9 引物：上游与下游引物见附录B表B.1，浓度10 μmol/L。

4 仪器与设备
4.1 PCR仪：温度范围4.0℃～99.9℃，样品基座至少包括单个0.2 mL孔。
4.2 凝胶成像系统：检测灵敏度DNA≥0.1 ng，有效像素1360×1024，10 bit，USB 2.0。
4.3 台式低温高速离心机：最高转速16000 r/min，容量1.5 mL×12。
4.4 电泳仪：电压50V~120V，电流10mA~800mA，定时0~999 min。
4.5 电泳槽：耐高温、耐腐蚀、不漏液，缓冲液容量充足。
4.6 冰箱：具冷藏功能。
4.7 微量移液器：单道可调，量程0.5~10 μL、2~20 μL、10~100 μL、100~1000 μL。
4.8 水浴锅：温度范围室温~100℃。

5 样品
5.1 阴阳性对照：阳性对照使用灭活禽腺病毒4型鸡胚尿囊液，阴性对照使用正常鸡胚尿囊液或家禽组织，对照样品均在-20℃保存。
5.2 样品采集与处理
5.2.1 采集工具：棉拭子、剪刀、镊子、1.5 mL离心管、研钵，经121℃高压灭菌20 min并烘干。
5.2.2 棉拭子采集：将棉拭子深入咽喉或肛门转一圈，放入盛有1.0 mL PBS的1.5 mL离心管，加盖编号。
5.2.3 组织采集：使用剪刀采集心、肝、脾、肺、肾、法氏囊等组织，放入一次性灭菌容器，编号。
5.2.4 样品储运：采集后放入塑料袋密封，加冰保温，24h内送至实验室。
5.2.5 样品处理
5.2.5.1 棉拭子处理：离心管在混合器上充分混合，用高压灭菌镊子挤出液体，4℃条件下3000 r/min离心15 min，取上清液转入无菌1.5 mL离心管编号备用。
5.2.5.2 组织处理：组织置于洁净灭菌盘中，按质量体积比1:5加入样品保存液充分研磨，4℃条件下3000 r/min离心。