【地方标准】 畜禽疫病防治与净化技术规范 第1部分：猪繁殖与呼吸综合征病毒经典株与高致病性变异株RT-PCR鉴别检测方法

ICS 11.220
B41
备案号：58536-2018
辽宁省地方标准
DB21/T 2827.1—2017

畜禽疫病防治与净化技术规范
第1部分：猪繁殖与呼吸综合征病毒经典株与高致病性变异株RT-PCR鉴别检测方法
Technical specifications of prevention and eradication of animal epidemic disease Part 1: A RT-PCR method to differentiate the highly pathogenic and classical porcine reproductive and respiratory syndrome virus

2017-10-27发布
2017-11-27实施
辽宁省质量技术监督局发布

前言
本标准《畜禽疫病防治与净化技术规范》按照GB/T 1.1—2009给出的规则起草，分为多个部分。本部分为第1部分，由辽宁省动物疫病预防控制中心提出并归口。

1 范围
本标准规定了猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）美洲经典株与高致病性变异株RT-PCR检测方法的实验材料、仪器设备、试剂、操作步骤和结果判定，并介绍了其原理。
本标准适用于猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）感染猪血清及临床病料等样品中病毒核酸检测。

2 规范性引用文件
凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本文件。GB/T 6682—1992 分析实验室用水规格和试验方法。

3 缩略语
DEPC：焦炭酸乙酯
RNA：核糖核酸
RT-PCR：反转录聚合酶链反应
dNTP：脱氧核苷酸三磷酸
bp：碱基对

4 原理
PRRSV为RNA病毒，其RNA经反转录生成cDNA后可作为PCR扩增模板。根据高致病性PRRSV基因组非结构蛋白Nsp2编码区缺失90个核酸的特点，在缺失区域两端设计引物。在DNA聚合酶作用下，通过变性、退火和延伸过程，经典株与高致病性变异株扩增出不同大小的DNA片段，从而实现鉴别检测。

5 实验材料、仪器设备和试剂

5.1 实验材料
眼科剪、眼科镊、称量纸、1.5 mL灭菌离心管（经DEPC水处理）、0.2 mL薄壁PCR管、琼脂糖、500 mL量筒、500 mL三角瓶、吸头（10 μL、200 μL、1000 μL）。

5.2 仪器设备
分析天平、低温高速离心机、PCR扩增仪、电泳仪、电泳槽、紫外凝胶成像仪（或紫外分析仪）、-70℃冰箱、微波炉、组织研磨器、-20℃冰箱、可调移液器（2 μL、20 μL、200 μL、1000 μL）。

5.3试剂
5.3.1 2.5 mmol/L dNTP
5.3.2 引物：上游引物5'-CGAATCAGACAACCGAACA-3'，下游引物5'-GACGCAGACAAATCCAGAG-3'
5.3.3 10×PCR缓冲液
5.3.4 1%溴化乙锭（EB）溶液
5.3.5 电泳缓冲液（50×）
5.3.6 1%琼脂糖凝胶

6 操作步骤
（原文该部分OCR缺失较多，仅保留结构）
6.1 样品处理与核酸提取
6.2 RT-PCR检测体系构建
6.2.1 PCR质反应体系组成
6.2.2 扩增体系配制与加样
6.2.3 RT-PCR反应程序设置
6.2.4 电泳检测

7 结果判定
（原文缺失）

附录A（规范性附录）试剂的配制