【地方标准】 胡椒瘟病病原菌分子检测技术规范

ICS65.020.01
CCS B16
海南省地
方标准
DB46/T711—2025
胡椒瘟病病原菌分子检测技术规范Technical specification for pathogen molecular detection of black pepper Phytophtorafootrot
2025-08-11发布
海南省市场监督管理局
2025-10-31实施
规范性引用文件
术语和定义
原理，
5器材与试剂
5.1主要器材
5.2主要试剂
6检测方法
6.1样品采集
6.2DNA提取.
6.3PCR反应
6.4PCR产物检测
7结果判定
8结果记录与档案保存
9样品处置
附录A（资料性）
附录B（资料性）
参考文献
胡椒瘟病病原菌分子检测报告表PCR产物电泳图谱
图B.1PCR产物电泳图谱
表1PCR反应体系
表A.1胡椒瘟病病原菌分子检测报告表次
DB46/T711—2025
DB46/T711—2025
本文件按照GB/T1.1一2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。
请注意本文件的某些内容有可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本文件由海南省农业农村厅提出并归口。本文件起草单位：中国热带农业科学院香料饮料研究所。本文件主要起草人：高圣风、王亚男、苟亚峰、孙世伟、刘世超、杨建峰、田甜、温思为。I
1范围
胡椒瘟病病原菌分子检测技术规范DB 46/T711—2025
本文件确立了胡椒瘟病病原菌（Phytophtoracapsici）PCR检测的原理，规定了器材和试剂、检测方法、结果判定、结果记录与档案保存、样品处置的要求和方法本文件适用于胡椒种苗及大由植株上的胡椒瘟病病原菌的PCR检测。2规范性引用文件
下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件仅该日期对应的版本适用于本文件：不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。
GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法NY/T3816热带作物病虫害监测技术规程胡椒瘟病3术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。3.1
胡椒瘟病blackpepperPhytophthorafootrot由辣椒疫霉菌（Phytophthoracapsici）引起的胡椒卵菌病害，又称胡椒基腐病[来源：NY／T3816—2020，2.1，有修改］3.2
polymerasechainreaction，PcR聚合酶链式反应
先高温变性，使模板DNA成为单链；接着降温退火，使单链与引物通过碱基互补进行结合；再中温延伸，在DNA聚合酶的作用下以四种脱氧核糖核酸（dNTP）为底物，使新链沿引物方向合成延伸；然后循环扩增，通过多次重复变性、退火和延伸过程使靶标片段以几何倍数扩增[来源：NY／T2252—2012，2.3，有修改】4原理
三磷酸鸟苷（GTP)结合蛋白基因（YptI)在疫霉属（Phytophthora）的物种间存在丰富的变异，而在物种内却高度保守，可以为疫霉菌的PCR检测提供理想的靶序列。根据胡椒瘟病病原菌YptI设计特异性引物进行PCR扩增。依据是否扩增获得预期230bp的DNA片段，判断样品中是否携带胡椒瘟病病原菌。5器材与试剂
5.1主要器材
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组织研磨器、台式离心机、冰箱、PCR检测仪、电泳仪、凝胶成像仪、冰箱、剪刀、镊子、样品密封容器、1.5mL离心管、研磨件、可调量程移液器（0.1μL～2.5μL，0.5μL～10μL，10μL~100μL，100μL～1000μL）、吸头、0.2mLPCR管等，其中接触样品的器材应是洁净无菌的。5.2主要试剂
5.2.1通用要求/试剂纯度等级
除另有规定外，所有试剂的纯度均为分析纯或生化试剂。实验室用水应符合GB/T6682要求。5.2.2DNA提取试剂
推荐使用一步法DNA提取缓冲液，配制方法为：在900mLddH20水中加入1.46g氯化钠、2.42g三羟甲基氨基甲烷（Tris）、20g聚乙烯吡咯烷酮（PVP-40）、0.73g乙二胺四乙酸（EDTA）、0.5g十二烷基硫酸钠（SDS），用1mo1/L盐酸调整pH至8.0，定容至1000mL。室温保存。可选择植物或真菌DNA提取试剂或试剂盒。5.2.3PCR反应试剂
见表1，或采用同类型的PCR扩增试剂或试剂盒。其中PCR引物的序列如下：上游引物：5’-GACGTTTTAGTTAGAGCAC-3；下游引物：5”-AATGGCACTGAAGTTCTG-3”。5.2.4凝胶检测试剂
琼脂糖、Tris-乙酸（TAE）缓冲液（40mmo1/LTris-乙酸，1mmo1/LEDTA，pH8.0）、上样缓冲液（loadingbuffer）、DNA分子量Marker、GoldView或同类核酸染料。6检测方法
6.1样品采集
按照NY／T3816的相关规定进行田间诊断，对于带有疑似胡椒瘟病症状的植株，选择病健交界部位采集长度为5cm～10cm的病蔓，或者整片病叶；对于未表现症状的胡椒植株，随机采集离地表20cm内的叶片5片。样品应放入密闭容器内，室温存放时间不宜超过48h，长期保存应置于-70℃及以下温度环境。取样信息填入表A.1。
6.2DNA提取
取30mg～50mg病健交界处组织或叶片，剪碎后放入1.5mL的离心管中。加入500μLDNA提取缓冲液，用组织研磨器研磨成匀浆。10000×g离心2min，将上清液转移至新的1.5mL离心管中，即为DNA模板。冷藏贮存不宜超过3h，长期保存应置于-20℃及以下温度环境。6.3PCR反应
6.3.1PCR反应体系
PCR反应体系按照表1的规定配制，或采用同类型的试剂及试剂盒依照产品说明书配制。以胡椒瘟病叶片提取的DNA为阳性对照，以健康胡椒叶片提取的DNA为阴性对照，以无菌ddH:0为空白对照。2
10XPCR缓冲液（MgFree）
25mmol1/LMgC1s
dNTPs（各2.5mmo1/L）
10μmo1/L上游引物
10μmo1/L下游引物
TaqDNA聚合酶（5U/μL）
无菌ddH.o
6.3.2PCR扩增程序
表1PCR反应体系
用量（L）
补足至25
DB46/T711—2025
94℃预变性3min；94℃变性30S，55℃退火30s，72℃延伸30S，35个循环；72℃延伸7min。6.4PCR产物检测
用TAE电泳缓冲液制备1%的琼脂糖凝胶，按比例将1oadingbuffer和PCR产物混匀后加至样品孔中用DNAMarker做分子量的标记，进行电泳分析，电泳结束后，在凝胶成像仪下观察是否扩增出230bp的DNA电泳条带，拍照记录实验结果。7
结果判定
根据PCR产物凝胶电泳图中是否出现230bp条带判定检测结果。检测结果仅在阳性对照出现目的条带且阴性对照、空白对照均未出现目的条带时有效。若泳道出现目自的条带则判定结果为阳性，代表该样品携带胡椒瘟病病原菌；若泳道未出现目的条带则判定结果为阴性，代表该样品不携带胡椒瘟病病原菌。结果记录与档案保存
检测结果填入表A.1.
PCR产物凝胶电泳图和表A.1等档案保存1年。样品处置
阳性样品应保存90d，以备复核。保存期满后须进行灭活处理。3
DB46/T711—2025
附录A
（资料性）
胡椒瘟病病原菌分子检测报告表胡椒瘟病病原菌分子检测报告表见表A.1。表A.1
胡椒瘟病病原菌分子检测报告表送检日期
送检人
联系电话
送检单位
检测方法：
检测结果：
备注：
检测人（签名）：
审核人（签名）：
采样日期
采样地点
样品数量
收样人
检测单位（盖章）：
注：本单一式两联，第一联送检单位存档，第二联检测单位存档。4
PCR产物凝胶电泳图谱见图B.1。M
2000bp
1000bp
标引序号说明：
DNAMarker;
阳性对照；
阴性对照；
空白对照；
4～6-
阳性；
阴性。
附录B
（资料性）
PCR产物电泳图谱
PCR产物电泳图谱
DB46/T711—2025
DB46/T711—2025bzxz.net
参考文献
[1]NY/T2252—2012
槟榔黄化病病原物分子检测技术规范[2]］NY/T3816-2020热带作物病虫害监测技术规程胡椒瘟病6
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