【地方标准】 胡椒瘟病病原菌分子检测技术规范

胡椒瘟病病原菌分子检测技术规范（DB46/T711—2025） 本文件按照GB/T 1.1-2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。 请注意，本文件的某些内容可能涉及专利，本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本文件由海南省农业农村厅提出并归口，中国热带农业科学院香料饮料研究所负责起草，主要起草人包括高圣风、王亚男、苟亚峰、孙世伟、刘世超、杨建峰、田甜和温思为。 1 范围 本文件确立了胡椒瘟病病原菌（Phytophthora capsici）PCR检测的原理，规定了器材与试剂、检测方法、结果判定、结果记录与档案保存、样品处置的要求和方法，适用于胡椒种苗及大规模植株上的胡椒瘟病病原菌的PCR检测。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款： - GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 - NY/T 3816 热带作物病虫害监测技术规程 3 术语和定义 3.1 胡椒瘟病（black pepper Phytophthora footrot） 由辣椒疫霉菌（Phytophthora capsici）引起的胡椒卵菌病害，又称胡椒基腐病。 3.2 PCR（Polymerase Chain Reaction） 聚合酶链式反应：通过高温变性、退火与延伸等过程，利用DNA聚合酶在特定条件下扩增目标DNA片段。 4 原理 胡椒瘟病病原菌YptI基因在疫霉属（Phytophthora）的物种间具有丰富的变异性，但在物种内高度保守，适合用于疫霉菌的PCR检测。通过设计特异性引物进行PCR扩增，根据是否获得预期230bp的DNA片段，判断样品是否携带胡椒瘟病病原菌。 5 器材与试剂 5.1 主要器材 - 组织研磨器 - 台式离心机 - 冰箱 - PCR检测仪 - 电泳仪 - 凝胶成像仪 - 冰箱、剪刀、镊子等 5.2 主要试剂 5.2.1 通用要求 试剂纯度为分析纯或生化试剂，实验室用水应符合GB/T6682要求。 5.2.2 DNA提取试剂 推荐使用一步法DNA提取缓冲液，配制方法为：在900mL ddH2O中加入1.46g氯化钠、2.42g三羟甲基氨基甲烷（Tris）、20g聚乙烯吡咯烷酮（PVP-40）、0.73g乙二胺四乙酸（EDTA）、0.5g十二烷基硫酸钠（SDS），用1mol/L盐酸调整pH至8.0，定容至1000mL。 5.2.3 PCR反应试剂 PCR反应试剂可见表1，或使用同类型的PCR扩增试剂或试剂盒。引物序列如下： - 上游引物：5’-GACGTTTTAGTTAGAGCAC-3 - 下游引物：5’-AATGGCACTGAAGTTCTG-3 6 检测方法 6.1 样品采集 6.2 DNA提取 6.3 PCR反应 6.4 PCR产物检测 7 结果判定 8 结果记录与档案保存 9 样品处置 附录A（资料性） 附录B（资料性） 参考文献 图B.1 PCR产物电泳图谱 表1 PCR反应体系 表A.1 胡椒瘟病病原菌分子检测报告表