【地方标准】 饲料中黄曲霉毒素B1、呕吐毒素、伏马毒素B1和玉米赤霉烯酮的测定 高效液相色谱-串联质谱法

DB37/T3856-2019
饲料中黄曲霉毒素B1、呕吐毒素、伏马毒素B1和玉米赤霉烯酮的测定 高效液相色谱-串联质谱法
2019-12-31发布
2020-01-31实施
山东省市场监督管理局

前言
本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。本标准由山东省畜牧兽医局提出并组织实施。本标准由山东省畜牧业标准化技术委员会提出并归口。本标准起草单位：青岛农业大学、德州学院、山东省农业科学院家禽研究所。
本标准主要起草人：朱连勤、陈甫、高晨、朱风华、李福伟、邱慧玲、王倩文、孙京新。

DB37/T3856-2019
饲料中黄曲霉毒素B1、呕吐毒素、伏马毒素B1和玉米赤霉烯酮的测定 高效液相色谱-串联质谱法
警示：由于黄曲霉毒素B1、呕吐毒素、伏马毒素B1和玉米赤霉烯酮等霉菌毒素是毒性很强的有毒物质，应小心处理，分析操作过程应在通风橱内或指定区域内进行。分析过程中，操作者应采取相应的防护措施，应穿工作服、戴眼镜、口罩、医用乳胶手套，避免吸入、接触霉菌毒素溶液。分析结束后，凡接触过霉菌毒素的器皿及霉菌毒素溶液应使用浓度为5%次氯酸钠溶液浸泡过夜后清洗。为了降低接触霉菌毒素的机会，本标准鼓励直接购买并使用霉菌毒素的有证标准储备液。

1 范围
本标准规定了饲料中黄曲霉毒素B1、呕吐毒素、伏马毒素B1和玉米赤霉烯酮含量测定的高效液相色谱-串联质谱测定方法。
本标准适用于饲料原料、配合饲料、浓缩饲料、精料补充料、添加剂预混料中黄曲霉毒素B1、呕吐毒素、伏马毒素B1和玉米赤霉烯酮含量的测定。本方法中黄曲霉毒素B1、呕吐毒素、伏马毒素B1和玉米赤霉烯酮的检出限分别为0.005μg/kg、10μg/kg、10μg/kg和0.10μg/kg。

2 规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。
GB/T6682 分析实验室用水规格和试验方法
GB/T14699.1 饲料采样
GB/T20195 动物饲料试样的制备

3 原理
试样中的黄曲霉毒素B1、呕吐毒素、伏马毒素B1和玉米赤霉烯酮经乙腈溶液提取，再经滤纸和有机滤膜净化，采用高效液相色谱-串联质谱法测定，外标法定量。

4 试剂或材料
除非另有规定，在分析中仅使用确认为分析纯的试剂。
4.1 水：符合GB/T6682中规定的一级用水。
4.2 乙腈：色谱纯。
4.3 甲醇：色谱纯。
4.4 甲酸：色谱纯。
4.5 醋酸铵：优级纯。
4.6 提取溶液：准确量取乙腈840mL和水160mL，混匀，即得。
4.7 甲酸溶液（0.4%）：准确量取甲酸4mL加水定容至1000mL，混匀，即得。
4.8 醋酸铵溶液（1%）：准确称取醋酸铵1.0000g加水定容至100mL，混匀，即得。
4.9 甲酸醋酸铵溶液：取甲酸溶液（4.7）50mL加醋酸铵溶液（4.8）50mL，混匀，即得。
4.10 黄曲霉毒素B1对照品：纯度≥98.0%。
4.11 玉米赤霉烯酮对照品：纯度≥98.0%。
4.12 伏马毒素B1对照品：纯度≥98.0%。
4.13 呕吐毒素对照品：纯度≥98.0%。
4.14 标准储备溶液：分别精确称取4种霉菌毒素对照品至棕色容量瓶中，用提取溶液（4.6）配成浓度为1000μg/mL的霉菌毒素标准储备溶液，-20℃保存，有效期为6个月。或使用有证标准溶液。
4.15 混合标准储备溶液：分别精密量取4种霉菌毒素标准储备溶液1mL，置于棕色容量瓶中，用提取溶液（4.6）定容至100mL，配置成浓度为10.0μg/mL的混合标准储备溶液，4℃保存。
4.16 标准系列工作溶液：将混合标准储备溶液用乙腈稀释成0.01ng/mL、0.10ng/mL、1.0ng/mL、10.0ng/mL、100.0ng/mL、1000.0ng/mL的混合标准系列工作溶液，临用新配。
4.17 针头式过滤器：有机型，孔径0.22μm。

5 仪器设备
5.1 高效液相色谱-串联质谱仪：配有电喷雾电离源。
5.2 旋涡混合器
5.3 分析天平：感量为0.1mg。
5.4 气浴摇床。

6 样品
按GB/T14699.1规定采集有代表性的试样，按照GB/T20195规定将试样粉碎，过0.42mm分析筛混匀装入密闭容器中，备用。

7 试验步骤
7.1 试样处理
平行做两份试验。称取5.000g（精确到0.0002g）试样置于50mL具塞锥形瓶中，准确加入25.0mL提取溶液（4.6），室温下涡旋混匀大于2min，置于120r/min气浴摇床中提取1.0h，取出用中速定量滤纸过滤，取5.0mL滤液，经0.22μm针头式过滤器过滤后，待测。
7.2 标准系列
分别取1mL标准系列工作溶液（4.16）于具塞离心管中，经0.22μm针头式过滤器过滤后，待测。
7.3 液相色谱-串联质谱法条件
7.3.1 液相色谱参考条件
色谱柱：C18柱，100mm×2.1mm，粒径1.8μm或性能相当者。
柱温：33℃。
进样体积：20μL。
流动相A：乙腈。
流动相B：甲酸醋酸铵溶液。
流速：0.2mL/min。
流速及梯度洗脱条件见表1：
表1 流动相梯度洗脱条件
时间 (min) | 0 | 2 | 6 | 8 | 8.1 | 10
流动相A (mL/min) | 0.2 | 0.2 | 0.2 | 0.2 | 0.2 | 0.2
流动相B (% v/v) | 20 | 20 | 50 | 100 | 100 | 20

7.3.2 质谱参考条件
离子源：电喷雾离子源（ESI）
扫描方式：正/负离子扫描模式。
检测方式：多离子反应监测（MRM）
脱溶剂气、锥孔气：氮气。
碰撞气：高纯氮气。

表2 质谱测定参考值
霉菌毒素 | 定性离子对 (m/z) | 定量离子对 (m/z) | 锥孔电压 (V) | 碰撞能量 (eV)
黄曲霉毒素B1 | 313.1 > 241.0 | 313.1 > 241.0 | 40 | 32
呕吐毒素 | 297.2 > 265.1 | 297.2 > 265.1 | 24 | 27
伏马毒素B1 | 722.4 > 334.1 | 722.4 > 334.1 | 50 | 34
玉米赤霉烯酮 | 317.0 > 175.1 | 317.0 > 175.1 | 15 | 26

8.1 标准工作曲线与监测图
在上述液相色谱-串联质谱法条件下，测定前确定各气体流量以使质谱灵敏度达到要求，毛细管电压、锥孔电压、碰撞能量等电压值应优化至最高灵敏度。将霉菌毒素标准系列溶液、试样溶液置于液相色谱-串联质谱仪，测定相应的峰面积，采用单点或多点校正，外标法定量。4种霉菌毒素质谱图参见附录A，多离子反应监测色谱图参见附录B。
8.2 定性测定