【地方标准】 饲用微生物制剂中粪肠球菌的检测方法

ICS 65.120
B46
DB21 辽宁省地方标准
DB21/T3061—2018

饲用微生物制剂中粪肠球菌的检测方法
Method for detection of Enterococcus faecalis in feeding microbial preparations

2018-10-30发布
2018-11-30实施
辽宁省市场监督管理局 发布

前言
本标准按照GB/T 1.1—2009和GB/T 20001.4—2015给出的规则起草。本标准由辽宁省畜牧兽医局提出并归口。本标准起草单位：辽宁省兽药饲料畜产品质量安全检测中心。本标准主要起草人：李欣南、武凤娇、韩镌竹、高铎、田晓玲。

1 范围
本标准规定了饲用微生物制剂中粪肠球菌的检验与计数方法。本标准适用于含有益微生物粪肠球菌的各种饲料添加剂中粪肠球菌的检测和计数。

2 规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期版本适用；凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有修改单）适用。
GB 4789.2 食品安全国家标准 食品微生物学检验 菌落总数测定
GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法
GB/T 8170 数值修约规则与极限数值的表示和判定
GB/T 14699.1 饲料采样
GB 19489 实验室生物安全通用要求
GB/T 20195 动物饲料试样的制备

3 稀释液、培养基及试剂
实验用水电导率在25℃时不应超过25 μS/cm（相当于电阻率>0.4 MΩ·cm），微生物污染不超过10 CFU/mL。按GB 4789.2执行相关要求。
3.1 0.85%灭菌生理盐水。
3.2 粪肠球菌琼脂培养基（见附录A.1）。
3.3 哥伦比亚血琼脂培养基（见附录A.2）。
3.4 革兰氏染色液（见附录A.3）。
3.5 革兰氏阳性菌鉴定卡或生化鉴定试剂。
3.6 PCR鉴定试剂盒。

标准菌株：粪肠球菌 ATCC 29212。

4 设备和玻璃器具
4.1 恒温培养箱（36℃±1℃）。
4.2 高压灭菌锅（121℃）。
4.3 微生物鉴定仪。
4.4 涡旋仪（0～2500 r/min）。
4.5 麦氏比浊仪（0～5 MCF）。
4.6 显微镜（≥400倍）。
4.7 无菌采样袋/瓶。
4.8 天平（0.01 g～410 g）。
4.9 冰箱（2℃～8℃）。
4.10 离心管（50 mL）。
4.11 平皿（直径90 mm）。
4.12 L形涂布棒。
4.13 移液器（0.1 mL、1 mL、10 mL）。
4.14 三角瓶或广口瓶（500 mL）。

5 采样
实验室样品应具有真实性和代表性。采样应佩戴无菌手套与口罩，采样工具应为无菌器具。样品采集后于2℃～8℃冷藏保存。采样数量与方式按GB/T 14699.1执行。

6 试样的制备
（内容缺失/未完整识别）

7 操作步骤
7.1 检样制备及稀释
在超净工作台中称取试样25 g（或mL），加入225 mL 0.85%灭菌生理盐水（三角瓶内预置玻璃珠），振荡30 min。充分混匀后按1:10进行稀释，逐级稀释至所需浓度。

7.2 接种和培养
选取2～3个适宜稀释度，每个取0.1 mL接种于粪肠球菌琼脂平板，每个浓度做两个平板，用无菌涂布棒涂布均匀。室温吸收15 min后倒置于36℃±1℃培养箱中培养48 h±1 h。

7.3 菌落计数及筛选
选取菌落数30～300 CFU的平板进行计数。典型菌落呈圆形、光滑、隆起，颜色为黑色或淡黑色，直径0.5～2.0 mm。选取5个典型菌落进行确证试验。

7.4 鉴定试验
7.4.1 菌种制备：从平板挑取单菌落，接种于哥伦比亚血琼脂培养基进行划线培养。