【地方标准】 牡蛎疱疹病毒?型检测技术规范 巢式PCR法

DB37/T3673—2019
牡蛎疱疹病毒I型检测技术规范
巢式PCR法

发布机构：山东省市场监督管理局
发布日期：2019-09-30
实施日期：2019-09-30

前言
本标准按照GB/T 1.1—2009给出的规则起草。本文件的某些内容可能涉及专利，本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本标准由山东省农业农村厅提出并监督实施，本标准由山东省渔业标准化技术委员会（鲁TC03）归口。
本标准起草单位：山东农业大学、济宁滨阳生物科技股份有限公司、泰安益海生物科技有限公司、泰安智博生物科技有限公司、南京根洋生物科技有限公司、南京少伯生物科技有限公司、南京福海生物科技有限公司。
本标准起草人：王雪鹏、丁雷、闫现广、王方鹏、郭志明、孙永灿、付天增、姜衡、黄金菁。

1 范围
本标准规定了牡蛎疱疹病毒I型（Ostreid herpesvirus-1，OsHV-1）的巢式PCR检测方法，适用于对贝类样品进行疱疹病毒型带毒情况的定性检测，以进行牡蛎疱疹病毒型的流行病学调查、诊断、检疫和监测。

2 规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。
GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法
SC/T 7205.1 牡蛎包纳米虫病诊断规程

3 术语和缩略语
3.1 术语和定义
3.1.1 牡蛎疱疹病毒I型
牡蛎疱疹病毒I型属于软体动物疱疹病毒科（Malacoherpesviridae）、牡蛎疱疹病毒属（Ostreavirus），是一种双链DNA病毒，在世界范围内广泛流行，主要危害牡蛎、扇贝和魁蚶等多种双壳贝类，对贝类养殖业造成重大的损害。
3.2 缩略语
bp：碱基对（base pair）
dNTPs：脱氧核糖核苷三磷酸（deoxyribonucleoside triphosphate）
DNA：脱氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid）
EB：溴化乙啶（ethidium bromide）
EDTA：乙二胺四乙酸（ethylenediamine tetraacetic acid）
PCR：聚合酶链式反应（polymerase chain reaction）
Taq：水生栖热菌（Thermus aquaticus）
TE：Tris盐酸和EDTA缓冲液（Tris-HCl and EDTA buffer）
Tris：三羟甲基氨基甲烷（tris(hydroxymethyl)aminomethane）

4 试剂及仪器
4.1 试剂
4.1.1 除非另有说明，实验用水均为GB/T 6682规定的三级水或相当纯度的水。
4.1.2 无水乙醇：分析纯。
4.1.3 TE缓冲液按附录A.1的规定。
4.1.4 抽提缓冲液按附录A.2的规定。
4.1.5 蛋白酶K按附录A.3的规定。
4.1.6 10mol/L乙酸铵按附录A.4的规定。
4.1.7 Tris、饱和酚（pH≥7.8）：分析纯。
4.1.8 酚/氯仿/异戊醇 (25:24:1)：分析纯。
4.1.9 氯仿/异戊醇 (24:1)：分析纯。
4.1.10 50×TAE：见附录A.5，也可以直接购买市售产品。
4.1.11 1×TAE：见附录A.5。
4.1.12 70%乙醇按附录A.6的规定。
4.1.13 dNTP（各2.5mmol/L）：生化试剂，含dATP、dTTP、dGTP、dCTP各2.5mmol/L的混合物，-20℃保存，用于PCR。
4.1.14 10X PCR反应缓冲液：见附录A.7，也可以直接购买市售产品。
4.1.15 MgCl2（25mmol/L）：生化试剂，-20℃保存。
4.1.16 Taq DNA聚合酶（5U/μL）：生化试剂，-20℃保存。
4.1.17 外引物 CF：5”-ATTACCCAGATTCCCCTC-3”，-20℃保存。
4.1.18 外引物 CR：5'-CCACAAATGTAAACTGTGAC-3”，-20℃保存。
4.1.19 内引物 C3：5'-GTGTTCTATACCATACGACCTACA-3”，-20℃保存。
4.1.20 内引物 C2：5’-TTGCGTTCCGTGACTTCT-3”，-20℃保存。
4.1.21 PCR检测阳性对照：已知受牡蛎疱疹病毒I型感染的贝类组织样品，-80℃保存。
4.1.22 PCR检测阴性对照：已知未受牡蛎疱疹病毒I型感染的贝类组织样品，-80℃保存。
4.1.23 PCR检测空白对照：以灭菌双蒸水作模板。
4.1.24 琼脂糖：分析纯，见附录A.8。
4.1.25 6x Loading Buffer：见附录A.9，也可以直接购买市售产品。
4.1.26 DNA分子量标准。
4.1.27 溴化乙锭（EB）：分析纯，10mg/mL，见附录A.10，或其他等效产品。

4.2 仪器
4.2.1 离心机
4.2.2 PCR仪
4.2.3 电泳仪
4.2.4 水平电泳槽
4.2.5 凝胶成像系统或紫外仪
4.2.6 多功能振荡器
4.2.7 水浴锅或金属浴
4.2.8 -20℃普通冰箱
4.2.9 -80℃超低温冰箱
4.2.10 微波炉、电炉或其他加热设备
4.2.11 微量移液器（量程0.5μL-1000μL）