【地方标准】 饲料中维生素A、维生素D3、维生素E的同步快速测定 高效液相色谱法

DB37/T3674—2019
山东省地方标准
饲料中维生素A、维生素D3、维生素E的同步快速测定
高效液相色谱法
2019-08-30发布 2019-09-30实施
山东省市场监督管理局 发布

前言
本标准按照GB/T 1.12009给出的规则起草。本标准由山东省畜牧兽医局提出并监督实施。本标准由山东省畜牧业标准化技术委员会归口。本标准起草单位：山东省饲料质量检验所、青岛市华测检测技术有限公司。本标准主要起草人：强莉、吕明春、刘雪芹、李斌、宫玲玲、李俊玲。

1 范围
本标准规定了饲料中维生素A乙酸酯、维生素D3、维生素E乙酸酯测定的高效液相色谱方法。本标准适用于复合预混合饲料、维生素预混合饲料中维生素A乙酸酯、维生素D3、维生素E乙酸酯的测定。其他饲料可参照执行。
本方法定量限：维生素A乙酸酯为10000 IU/kg；维生素D3为40000 IU/kg；维生素E乙酸酯为100 mg/kg。

2 规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。
GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法
GB/T 14699.1 饲料采样
GB/T 20195 动物饲料试样的制备

3 原理
试样中的维生素A乙酸酯、维生素D3和维生素E乙酸酯用二甲基亚砜（DMSO）超声溶解，经正己烷萃取浓缩、复溶后，供高效液相色谱仪测定，外标法定量。

4 试剂或材料
除非另有规定，仅使用分析纯试剂。
4.1 水：GB/T 6682，一级。
4.2 正己烷。
4.3 二甲基亚砜 (DMSO)：色谱纯。
4.4 甲醇：色谱纯。
4.5 维生素A乙酸酯标准储备溶液 (1 mg/mL)：称取维生素A乙酸酯标准品（CAS：127-47-9，纯度不低于99.0%）50 mg（准确至0.01 mg）于50 mL棕色容量瓶中，用甲醇（4.4）溶解定容。置-18℃冰箱保存，有效期为3个月。临用前利用紫外分光光度计检测其吸光度值，计算其准确浓度。（校正方法见附录A）。
4.6 维生素D3标准储备溶液 (1 mg/mL)：称取维生素D3标准品（CAS：67-97-0，纯度不低于99.0%）50 mg（准确至0.01 mg）于50 mL棕色容量瓶中，用甲醇（4.4）溶解定容。置-18℃冰箱避光保存。有效期为3个月。临用前利用紫外分光光度计检测其吸光度值，计算其准确浓度。（校正方法见附录A）。
4.7 维生素E标准工作溶液 (1 mg/mL)：称取DL-α-生育酚乙酸酯标准品（CAS：7695-91-2，纯度不低于99.0%）50 mg（准确至0.01 mg）于50 mL棕色容量瓶中，用甲醇（4.4）溶解定容。置-18℃冰箱避光保存。有效期为3个月。临用前利用紫外分光光度计检测其吸光度值，计算其准确浓度。（校正方法见附录A）。
4.8 维生素A标准工作液：准确吸取1.00 mL的维生素A标准储备液（4.5）于10 mL棕色容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀。维生素A标准工作液浓度为100 μg/mL。于-18℃保存，有效期为半个月。
4.9 维生素D3标准工作液：准确吸取0.50 mL维生素D3标准储备液（4.6）于10 mL棕色容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀。维生素D3标准工作液浓度为50 μg/mL。于-18℃保存，有效期为半个月。
4.10 析相分离纸：1 卷。
4.11 微孔滤膜：0.22 μm，有机相。

5 仪器设备
5.1 高效液相色谱仪：配有紫外或二极管阵列检测器。
5.2 电子天平：感量为0.1 mg和0.01 mg。
5.3 紫外分光光度计。
5.4 超声波振荡器。
5.5 振荡器：频率不低于250 次/min。
5.6 旋转蒸发器。
5.7 氮吹仪。
5.8 平底烧瓶（具塞）：棕色500 mL。

6 样品
按GB/T 20195制备试样，取不少于250 g样品，全部过1.0 mm孔径分析筛，筛上物不大于3%，混合均匀后，装入密闭容器中，于2～8℃避光保存。

7 试验步骤
7.1 提取
平行做两份试验。称取试样1～3 g（准确至0.1 mg），置于500 mL平底烧瓶中，加30 mL的DMSO（4.3），在超声波水浴中超声提取30 min（水温不宜超过35℃；中间旋摇2～3次以防样品附着瓶底），取出放置冷却。
注：在加入DMSO的过程中，小心试样结块。先倒入少许DMSO，振摇烧瓶，将试样播匀，再将剩余DMSO沿烧瓶壁冲洗，使附着在内壁的试样全部冲洗到烧瓶的底部。待冷却至室温后，准确加入100 mL正己烷（4.2），加盖、剧烈振摇（频率250 次/min）15 min，静置分层后再次准确加入100 mL正己烷（4.2），重复提取一次，静置。待正己烷层变澄清透明，且中间乳化层消失以后，将全部正己烷层萃取液经析相分离纸过滤，待测。
7.2 浓缩
准确移取一定体积的滤液（依据样品标示量、称样量和提取液用量确定分取量）置于旋转蒸发器烧瓶中，在不超过40℃条件下缓慢真空蒸发至近干或直接用氮气吹干。残渣用甲醇（4.4）溶解，并稀释...