【地方标准】 猪伪狂犬病毒实时荧光PCR检测方法

DB21/T2326-2014 猪伪狂犬病毒实时荧光PCR检测方法 前言 本标准按照GB/T1.1—2009起草，由辽宁省动物疫病预防控制中心提出，归口于辽宁省畜牧兽医局，起草单位包括辽宁省动物疫病预防控制中心和辽宁省动物医学研究院。主要起草人：陈瑶、赵晓彤、于学武、赵风菊、于长泳、张雅为、刘坤洋、杨国丽、邓文超、高志峰、关淼、李连昭、杨松柏。本标准于2014年7月5日发布，2014年9月5日实施。 1 范围 本标准规定了猪伪狂犬病毒（PRV）gG和gE基因荧光PCR检测方法的实验技术要求，适用于PRV的诊断、监测及流行病学调查。适用于猪脏器、血液和细胞培养物中PRV核酸的检测，并可根据免疫背景鉴别gE基因缺失疫苗毒与野毒感染。本标准中的试验操作应在生物安全II级（BSL-2）以上实验室进行。 2 规范性引用文件 下列文件对于本标准的应用是必不可少的。注日期的引用文件，仅所注日期版本适用；不注日期的引用文件，其最新版本（含所有修改单）适用。包括《兽医实验室生物安全技术管理规范》等。 3 缩略语 PRV：猪伪狂犬病毒（pseudorabies virus） HSTa酶：热启动Taq DNA聚合酶 Ct值：达到阈值的循环数 DNA：脱氧核糖核酸 荧光PCR：实时荧光定量聚合酶链式反应 PBS：磷酸缓冲液 4 原理 SYBR Green I是荧光定量PCR常用的DNA结合染料，可与PCR反应生成的双链DNA非特异性结合，发出荧光。通过检测体系中SYBR Green I的荧光强度，同时测定扩增产物DNA的熔解温度，可分析PCR产物的单一性，并检测扩增量。 5 仪器和器材 5.1 仪器：分析天平、高速离心机、荧光PCR扩增仪、-70℃冰箱、-20℃冰箱、水浴锅、可调移液器（2μL、20μL、200μL、1000μL）。 5.2 器材：组织匀浆器或研钵、眼科剪、眼科镊、10mL一次性注射器、1.5mL灭菌离心管、PCR八联排管或96孔板、吸头（10μL、200μL、1000μL）、灭菌双蒸水、称量纸。 6 试剂和材料 6.1 DNAzol Reagent：DNA抽提试剂，淡绿色，4~8℃保存。 6.2 SYBR Premix ExTaqTM II（Perfect Real Time）：用于Real Time PCR反应的预混液，含PCR Buffer、dNTP、RNase H、HSTaq酶及SYBR Green I染料，-20℃长期保存，融化后4~8℃保存。 6.3 PBS：0.02 mol/L，pH7.2。 6.4 无水乙醇：-20℃预冷。 6.5 75%乙醇：用无水乙醇和灭菌双蒸水配制，-20℃预冷。 6.6 阴性对照：灭菌双蒸水。 6.7 阳性对照：PRV细胞培养物。 注：除特殊标注外，均为分析纯。 7 操作步骤 7.1 样品采集、前处理、存放和运送 7.1.1 采样注意事项：采样及前处理过程中应戴一次性手套，避免样本间交叉污染。 7.1.2 采样工具：药匙、15mL和1.5mL离心管经121±2℃高压灭菌15min，剪刀、镊子经160℃干热灭菌2h。 7.1.3 内脏样品：采集病死或剖杀猪主要脏器（脑、淋巴结、脾脏、肺脏、肾脏），放入灭菌15mL离心管编号送实验室。取约100mg样品按1:5体积加入PBS，研磨均匀，1000g离心15min，取上清液转入1.5mL离心管编号备用。 7.1.4 血液样品：用无菌注射器采集血液，注入含1/104% EDTA溶液的无菌容器中，混匀编号备用。 7.1.5 细胞培养物：冻融三次，转入1.5mL离心管编号备用。 7.1.6 样品存放与运送：采集或处理样品应在2~8℃条件下保存。