【商检行业标准(SN)】 进出口食品中肉毒梭菌及其肉毒毒素的检验方法

中华人民共和国出人境检验检疫行业标准SN/T 0865—2000
进出口食品中肉毒梭菌及
其肉毒毒素的检验方法
Method for the determination of Clostridium botulinumand botulinum toxin in foods for import and export2000-06-22发布
2000-11-01实施
中华人民共和国国家出人境检验检疫局发布SN/T0865—2000
本标准是根据GB/T1.1一1993&标准化工作导则第1单元：标准的起草与表述规则第1部分：标准编写的基本规定》对原专业标准ZBX09005—1986出口食品肉毒梭菌及其毒素检验方法》进行修订的。
本标准从实施之日起，同时代替ZBX09 005：1986.
本标准的附录A是标准的附录。
本标准由中华人民共和国出入境检验检疫局提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国湖南出入境检验检疫局。本标准方要起草人：朱金国、欧阳健、杨建功。1范围
中华人民共和国出人境检验检疫行业标准进出口食品中肉毒梭菌及
其肉毒毒素的检验方法，
Method fur the dctcrmination of Ciostridium botwlinumand botulinum toxin in foods for import and export本标准规定了出口食品中肉梭菌及其肉毒毒素的检验方法。SN/T 0865—2000
代警ZR X09 005--1986
本标推适合下各种进山口食品及其原料中的肉毒梭菌和肉毒毒素的检验，有专门规定的枪验方法除外。
2引用标准
下列标准所包含的条文，通过在本标摊中引用而构成为本标准的条文。本标准出版时，所示版本均为有效，所有标准都会被修订，使用本标准的各方应探讨使用下列标准最新版本的可能性。GB4789.26—1994食品卫生微生学检验罐头食品商业.无荫的检验SN0330—1994出口食品中微生物学检验通则公职分析化学家协会（AOAC)官方分析方法（1995）食品中的肉毒校菌及其毒素（微生物学方泌）[AOAC Official Methods of Analysis(1995)977.26;ClostridiumBotulinum And Its Toxins in Foods(Micrabiological Method)]
3定义
本标准采用下列定义。
3.1肉毒梭菌clostridium hotulinum-种专性厌氧牛长并产生芽胞的革兰氏阳性杆菌，属厌氧性梭状芽胞杆菌属，在适宜的培养基及特的环境条件卜产生肉毒毒素。
3.2肉毒毒素botulinumtoxin
由肉毒梭菌产生的多类型的高分子不耐热蛋白质，为一-类对人类、高等浦乳动物和鱼类都具有很弱性的神经麻痹毒素。
4样品准备和制备
4.1初步检查
除未打开的罐装食品外，祥品要冷藏直到检验，对未打开的罐装食品，有严重膨胀和有爆裂危险的必须冷藏。检验前应记录产品名称、生产厂名、样品来源、产品的牛产批号和代号以及容器的情况。对容器进行清洁并作上供鉴别的标志。4.2固体食品
中华人民共和国国家出人境检验检疫局2000-06-22批准2000-11-01 实施
SN/T 0865 -2000
川无菌操作方法将固体食品样品移入灭荫研钵巾，加入等量的明胶磷酸盐缓冲液，并用火菌研性研磨，以备接种。亦可用火菌镊子取小块的食品直接放入增菌肉荡。4.3被体食品
川火菌吸管有接将液体食品接种到培养基中。4.4罐装食品
剥去罐头上的标签：检查外部缺陷，并作记录描述，用肥皂粉（或去污消毒液)和水清洗罐头，并用消毒液（有效浓度为100mg/.的次氯酸钠浒液)擦工作台面，将洗净并擦十的罐头放在工作台上同时进行编号标示。
川碘酒或其他有效的消毒剂先在罐头无代号的-端进行消毒，儿分钟后冉除去消毒剂，然后将罐头的这一端放在火焰上加热，直至工而的凝结水完全蒸发掉。若罐头己纶膨胀和变形，打开前应进行适当冷却，操作时使其垂直侧雌焊缝背向操作人员，用火焰烧时应特别小心，以避免罐头爆裂，用70头酒精浸混的棉球擦拭开罐器手柄和刀刃，并川火焰充分烧灼金属部分。川开罐器在罐头经消毒加热处理的部位开-一个人小适宜的孔不得损伤盖卷边）。打开膀罐时，可在开罐处加盖消洁灭菌的纱布，以防内容物外溅，小移动罐头，文即川无芮操作取出食品放培养基巾，4.5样品的外观和气味检查
检查足否有任何腐败现象，但不得品尝样品。记录检脊结果，4.6保疗样品
接种样品后，以无菌操作取至少25g样品放入火菌样品瓶.置于一18！下冷冻保存.以备后用：5检验方法
5.1原理
当沟毒毒素与相应的抗毒素浪合层，发生特异性结合，致使毒索的毒性全被抗毒素巾和而失去毒力。以含有大于1个小白鼠最小致死量(MID)的肉毒毒素的食品或培养物的提取液，注射于小白鼠胺腔内，在出现肉毒中毒症状之后，于96 h 内死亡。相应的抗毒素能中和肉毒毒素并能保护小白鼠免于出现症状，而其他抗毒素则不能。食品中存活的芽胞能在厌氢的境和适宜的培养条件下生长并产生毒素,得以检出和定型。
5.2培养基和试剂
除特殊规定外，所有化学试剂哟为分析纯，水为蒸馅水，5.2.1碘酒（碘4%，溶十70%乙醇中)。5.2.2疱肉培养基。
5.2.3含有胰蛋1酶的胰酪蛋白陈葡萄糖酵浸肾肉汤(TPGYT)。5.2.4原氧卵黄琼脂，
5.2.5明胶磷酸盐缓冲液.pH6.2
5.2.6尤水乙醇。
5.2.7苹兰氏染色液。
5.2.8结晶紫染色液。
5.2.9美蓝染色液。
5.2.10牛理盐水。
5.2.11多价肉毒毒素抗毒素（抗A、B.C、J)、E、F1,可出卫生部兰州生物制品研究所和关国亚特兰人疾病控制中心获得，
5.2.12胰蛋H酶溶液。
5.2.131mol/L氧氧化钠溶液。
5.2. 141 mol/L 盐酸
5.3设备和材料
5.3.1细菌学开罐器，
5.3.2研钵和研杆。
5. 3. 3 吸管:1. 0,5. 0, 10. 0和 25. 0 mL,SN/T 0865 2000
5.3.4培养试管（应有一些是带螺旋帼的），5.3.5厌鼠培养装置。
恒温培养箱，（26工1)C放（35士1)℃。5.3.7
显微镜(相差或明视野)，
5.3.8平，而底直经为90mm或100mm。5.3. 9高速冷冻离心机。
5.3.10用于接种小自鼠的注射器，1.0ml.或3.0ml.,带有5号针头。5.3.11小白鼠，体重约15～20g（每一试验批应使用同一品系和同一性别的小白鼠)。5.4检验步骤
5.4.1肉毒梭菌的检出
5.4. 1. 1增菌培养
接种前·先将增菌培养基煮沸 10 min～15 min,以排除溶解}培养基中伪瓦·并迅速冷却，切勿摇动。每15mL增菌肉汤中接种1~~2固体食品或1~2ml.液体食品，接种时将接种物慢慢接入肉汤液面之下，每份栏品接种两管应肉培养需，置（35土I)C培养，再按同样方法接种两管TPGYT肉荡，置（26士1）:培养，
5.4.1.2培养物的检查
培养5天后，检查培养物的浊度、产气、肉粒的消化并注意产生的气味。用显微镜检查经革“氏、结品紫或美蓝染色的培养物涂片·或取培养物以壶户在高倍相差显微镜下，观察菌体形态，升注意足否有典型的梭状菌是否形成芽胞和芽胞形成的程度以及芽胞在菌体内的部位.同时对每培养物作毒素检测。逆常培养5天后是闪毒梭菌的活跃生长期，每素的浓度最高·芽胞形故也达到高峰，为了分离纯培养吻·应保留芽胞形成商峰期的增菌培养物并拎藏。如采培养5大的增菌液巾没有细菌生长，应呼培养10以捡出能迟缓中芽的肉毒毅菌芽胞，5.4.2分离纯培养物
5. 4.2. 1前处理
取（1～2）m培养液或原性品置灭菌螺旋帽试管中，加人等量过滤除菌的无水乙。泥匀，在室温下放置「h。也可取(1-~2）ml.增菌培养物或原样品热（80C10 inin～15 min)以破坏其繁殖。但对非蛋户分解型肉毒梭菌不能加热处理。5.4.2.2涂平板
用接种环取1~2环经乙醇或加热处理的培养物或原样品在厌氢卵黄琼脂已划线接种，臣厌氧条件下（35士1)培养481，为了得到要挑取的单个菌落，必要时可将培养物稀释，为防止菌落蔓延成片，将琼脂平板表面下燥，
5.4.2.3典型肉毒梭菌菌落的挑选在每个平而上挑取约10个单个的典型菌落：肉毒梭菌的菌落为隆起或扁平，光消或粗糙。一般米说，它们穿易蔓延牛长并专不规则边缘。在卵黄培养基上用斜射光检查时，菌落丧面通常呈虹彩样，亦称为珠色层：彩带通常向外延仲，继而，菌落产牛不规则外形，除了珠色层外，在、和E型肉毒梭菌菌落周围通常有个宽度为2mm~Imn的黄色沉凝景，A和B型菌菌落的沉淀晕一般较窄，由了梭状芽胞杆菌属的·些其他细菌虽不产生莓素，竺能形成与肉毒梭菌的形态特征相似的菌落.排选产毒菌落比较困难。
.5.4.2.4菌落接种
SN/T 0865—2000
用灭菌接种环将挑选的每个菌落分别接种TPGYT肉汤和疱肉培养基各一管。按5.4.1.1、5.4.1.2所述的方法，将已接种的试管进行培养并作检查，然后按5.4.3中所述程序测试肉毒毒素。5.4.2.5确证试验
取5.4.2.4的培养物划线涂布于两个卵黄琼脂培养基，个平板在（35二1)作厌氧培养，另一个平板则作（35土1)℃需氧培养：如果仪在厌氧培养的平板上有典型的肉毒梭菌菌落牛长，而在有氧培养的平極上没有菌生长，则培养物可龍是纯的。在挑桃选的菌如果分离小出肉毒稷菌，意味暑在增菌培养基里的合菌相中,肉毒梭菌的数量相当少。冉通过增菌，反复转种,肉毒梭菌的数量可能会增加到足以使该菌分离出来。纯培养物应以芽胞状态用无菌、干燥的石英海砂或玻珠吸附后冷藏、冷冻或冻十
5.4.3肉毒毒素的测定
5.4.3.1样品制备
含有悬浮物的液态样品应当冷衍离心，敢真上清液作毒素测定：固体食品要加等体积pH6.2明胶磷酸盐缓冲液，用预冷的研钵和研杆研磨，3000/min，10min-~20min冷冻离心研磨的样品.用其上清液作毒素测定。
5.4.3.2胰酶处理
测毒素前，川胰蛋白酶处理-~部分食物上清液、液休食品或脑肉培养物。月mal/L氧氢化钠或1 mol/I.盐酸调节 pH到 6.2，取每种待检上清波1.8 mL加0.2 mL饱和胰酶水溶液，于 37C下孵育1h,间或轻轻摇动（饱和膜悔液制备：取1g1：250胰嗨放入到-个洁净的试筛中,加1CmL蒸馏水，不时播动，直到尽可能多的胰酶被溶解为止）。对TPGYT培养物则不用胰蛋白酶处理，因为这种培养基已含有胰酶.进一步处埋会降解培养物中已经充分活化的毒素。
5.4.3.3测定
把一部分未处理的样品液或培养物分别用明胶磷酸盐缓冲液作1：2.1：10和1：100稀释，把每份经胰酶处理的样品液或培养物也作同样的稀释。用1.0mL鼓3.0mL带有5号针头的注射器，取上述末稀释的液体和己稀释的不同浓度的液休各0.5ml.分别绘两只小白鼠作腹腔内注射。取1.5ml.末经处理的样品上清液或培养物在100℃加热10min，冷却后，取0.5ml.这种液体注射两只小白鼠。这两只小白鼠不应死广，因为即便注射液中有肉毒毒素，经过加热处理已被灭活。定时观察所有小白鼠96 h检查是否有肉毒中毒症状·记录症状和死亡清说。小自鼠肉毒中毒的典型症状通常在24h内出现，典型症状是：毛发竖立、呼吸闲难、四瘫痪；继而呼吸旱风箱式、腰部叫荫：宛若蜂腰;最终死于呼吸麻痹。小H鼠如没有肉毒中毒的临床症状而死亡，不能足以证明接种材料中含有肉毒毒素，有时，死亡是由丁接种液中存在其他化学物质或由于外伤所致，如出现小白鼠痒死，以致症状不明显，或经96h的观察后，如果除邯些注射「热处理的材料外的所有小白鼠均死亡，挪么就要用更高稀释度的上清液培养物重复试验。5.4.3.4确证试验
采用小白鼠体内中和保护试验法进行可毒素样品饰证实验：不论是样品液或培养物凡能致小自鼠发病、死亡者，取样进行适当稀释（检样的稀释应参考所归多价肉毒抗素的效价），如果是测是经骤酶处理的样品，则需制备新鲜的经胰酶处理的被试波，因胰酶的持续作用可能破坏毒素。
在给小白鼠注射可疑毒素稀释液以前30min-~60min，分别取多价肉毒抗毒素(.5ml.给每只小白鼠作腹腔注射,
将各稀彝度的可疑毒素样品液给注射多价肉毒抗毒素的小白鼠作腹腔注射，每只小白鼠注射0.5mL，每个稀释度注射两只小口鼠。同时用每一稀释度的样品液注射两只未注射抗每素的小白鼠作对照。
SN/T 0865—2000
观察小凸鼠96 h,注意注射肉毒杭毒素小白鼠和对照小白鼠的中症状,并记录死℃情况。注：如需对肉趣声素作进一步的分型测定,可参照其它对关的标准方法行测定。5.5结果解释
实验室检验旨在鉴定食品中的肉毒毒素和(或)菌体。对肉毒梭菌的检出和鉴定必须以产毒试验的结果为依据只有用肉毒毒素抗毒索保护的小白鼠免于肉毒中毒死心，方能证样品中有肉毒毒素行在，如果多价肉毒抗毒紊不能保护小白鼠，小白鼠可能是死于别的原因。如果经热处理和未经热处理的被试液都能使小白鼠死亡可能是被试液中存在其他耐热毒素物质，但要特别注意耐热毒素物质掩盖肉毒毒素存在的可能性。
A1疱肉培养基
新鲜牛肉
蛋白陈
酵母这膏
磷酸二氮钠(NaH,PO,H.O)
葡萄糖
可溶性淀粉
蒸馏水
SN/T 0865—2000
附录A
(标推的附录）
培养基和试剂的配制
1 000.0 mL.
将新鲜除脂肪和筋膜的牛肉50切碎，加蒸馏水，加热至沸点，再以文火煮1h。充分冷却，经纱布过滤，挤余液：加入其他成分用蒸馏水将波体体积补足至1000mL。调节pH至7.4.经粗滤纸过滤。可将肉汤和碎肉渣分别贮藏于冰箱内备用。在15mm×150mm试管中先加入碎肉渣至约3cm高然后加入肉汤，超过肉渣表面约4 rm.上面覆盖-层液体石蜡,厚度为 .3cm~0.4 cm，在121℃C高压灭菌 2们 min。
A2含有胰蛋白酶的胰蛋白陈葡萄糖酵母浸膏肉汤（TPGYT）A2. 1基础液
胰酪陈（trypticase）
蛋白陈
酵母汉膏
葡葡糖
硫乙醇酸钠
蒸馏水
1 000. 0 mL.
将固休成分溶于1000mL蒸馏水中，再分装15mm×150mm试管，每管15ml.。上面覆盖一层液体右蜡,厚度为 0.3 cm~～0. 1 cm，在121r下尚压灭菌10 min，最终 pH为7.2士0.1。放冰箱内保存,芥两周内不瓜则弃掉，临用前，将基础蔽用蒸气或煮沸加热 10 min～15 min，以排除游离氧,迅速冷却，以无菌操作每 15 mL肉汤加人1.(mT.胰梅.A2.2胰酶液
胰酶（I：250）
蒸馏馅水
100.0 ml.a
将胰酶溶解于蒸馏水中，用0.45pm微孔滤膜滤器过滬除菌A3厌氧卵黄琼脂
A3.1琼脂基础
酵母浸齐
氯化钠
蒸馏水
SN/T 0865—2000
1000.0mL.
在121℃下高压灭菌 15 min，最终 pH为 7.0±0.2.A3.2卵黄乳状液
用硬刷洗刷2~～3个鸡蛋,沥干。将鸡蛋放在0.1死氛化末溶液里浸泡1 h,取出沥干,再用70%酒精浸泡 30 min，取出鸡蛋,以无菌操作打开,弃去蛋白。用注射器取出蛋黄,放入灭菌容器，加等量灭菌生理盐水，允分混合，存丁4℃备用。A3.3培养制备
每500 ml.琼脂基础液(48r.～50C)加80 mI.卵黄乳状液，充分混合,制成平板。在室温下放置2,或35℃下放置24h，剔除污染的平板，将无菌平板存于冰箱，A4革兰氏染色液
A4.1Hucker氏草酸铵结晶紫液
a）中液：
结晶紫（染料含量90%）
95%乙醇
b)乙液：
草酸铵
蒸馏水
20.0 ml.。
80.0mL。
将甲液、乙液泥合。放置24 h,经粗滤纸过滤。e）革兰氏碘液：
碘化钾
蒸馏水
300. 0 mL
将碘化钾置研钵中,加人碘,用研杆研磨5 s～10 s;如1 ml.蒸馏水研磨;加5 ml 蒸馏水研磨:然后加10mL蒸馅水再研磨。将此溶液装入试剂瓶。期蒸馏水淋洗研钵和研杆，并收集洗液，使溶液的总体积成为300ml。
A4.2Huckcr氏对比染色液(母液）沙黄
95次乙醇
100. 0 ml..
将10mL母液加于90mL蒸馏水中即成A5结晶紫染色液
A5.1结品紫稀乙醇液
结晶紫（染料含90%）
95%乙醇
蒸馏水
20. 0 mL:
80. 0 ml.
A5.2草酸铵结晶紫（Huckcr氏）液（见A4.1）以上两者都被认为是稳定的作形态学检查的染色液。A6美蓝染色液（Loeffler氏）
a）甲液：
美蓝（染料含量90%）
95%乙醇
b）乙液：
稀释的氢氧化钾(0.01%）
将甲液、乙液混台即成，
A7消毒剂
A7.1 碘西
碘化钾
A7.2次氯毂钠溶液
次氯酸钠
蒸馏水
明胶磷酸盐缓冲液
磷酸氢二钠(NazHFO,)
蒸馏水
SN/T 0865--2000
30. 0 rnL.
100. () ml.
500.0 ml.。
5. 0 g~5.25g
100.Q mL.
1 000. 0 mL.
将明胶和磷酸盐加于蒸增水中，稍加热使溶解。121C高灭菌20min。最终PH为6.2A9
生理盐水
氯化钠
蒸馏水
1 000. 0 m1..
将氯化钠溶解于蒸馏水中，在 121℃高压灭菌 15 min,冷却至室温。A101mol/L氧化钠溶液
氢氧化钠
溶解于蒸馏水,并加至1U00 mI.。用丁调节培养基的pH。1/盐酸
盐酸(浓)
加蒸馏水至1000tnL，
SN/T 0865—2000免费标准下载网bzxz
PREFACE
This standard is a revision of ZB Xog 0051986\Method of the delermination of Clostridium botulinum and botulinum toxin in food for cxport\in accordance with GB/T 1,11993“Directives forihe Work of Standardization-Unit l; Drafting and Presentation of Standards-Part 1:Gencral Rulesfor Drafting Standards\
This standard is intended to replace ZB X09 005 1986,starting from the date it is put into effect.Annex A of this standard is an Appendix lo the siandard.This standard was proposed and filed by the State Adminisiratian of Entry-Exit Inspection and Quar-antine af the People's Rcpublic of China.This standard is drafted by Hunan Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau of the People's Republic af China.
Main draftsmen of thisstandard.Zhu Jinguo,OuYangjian,YangJiangongProfessional Standard of Entry-Exit Inspectionand Quarantine of the People's Republic of ChinaMethod for the determination ofClostridium botulinum and botulinumtoxin in foods for import and export1 Scope
SN/T0865—2000
Inreplacen
ZB x09 005—1986
This standard lays down the method of detecting Clostridium botulinum and botulinum loxin in foodsfor export.
This standard applies to the inspection af Clastridium batulinum and botulinum toxin in all kinds offood for export and the material for making them,except those of which there is specified method forthe inspection.
2 Standards Incorporated
Clauses in standards below-mentioned,having been incorporaled in this standard, become its compo-nent paris. Editions of the cited standards will still be effective when this standard is published. Asall standards are subjected to revisions, all parties concerned should study the possibilities of using thelatesl editions of thefollowing siandards:GB 4879. 26—1994 Microbiological exatnination ol faod hygiene—Examination of commercial steril-ization of canned food
SN 0330—1994 General guidance for microbiological examination of export foodsA0AC o[licial methods af analysis (1995) 977. 26:Clostridium Batulinutn and Its Toxins in Foods(Mictobiological Method)
3Definition
This standard adopts the following definitions :3.1 Closiridium botulinutn
A kind of strictly anaerobic spore-gencrating Gram-positive bacillus which produces botulinum toxinin suitable culture media undet certain circumstances. It falls into the family of anaerobic clostridialbacilli.
3.2 Botulinutn Toxin
Polytypic hypermolicular heat labile μrotein produced by Clostridium botulinum. A kind of nerve paralyzing toxin,highly poisonous to human hrings ,advanced mammals and fish.4 Preparation of sample
4. 1 Preliminary FxaminationApproved by the State Administration of En-try-Exit Inspection and Quarantine of the Peo-ple's Repubiic nf China, 06-22-200010
[mplemented on11-01-2000
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