【地方标准】 鲟鱼类志贺邻单胞菌病诊断技术规程

DB51/T 2910—2022 鲟鱼类志贺邻单胞菌病诊断技术规程
Technical specification for the diagnosis of Plesiomonas shigelloides for sturgeon

前言
本文件按照GB/T 1.1—2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。
本文件由四川省农业农村厅提出、归口并解释。本文件起草单位：四川省农业科学院水产研究所。本文件主要起草人：刘亚、龚全、赖见生、吴晓雲、陈叶雨、宋明江、杜军、刘光迅、周剑。本文件及其所代替文件的历次版本发布情况为：本次为首次发布。

1 范围
本文件规定了鲟鱼类志贺邻单胞菌病诊断的术语和定义、试剂和材料、设备和器材、临床检查、实验室样品采集、细菌分离与纯化、细菌鉴定、结果判定和综合判定等技术规程。本文件适用于达氏鲟（Acipenser dabryanus）和西伯利亚鲟（Acipenser baerii）的类志贺邻单胞菌（Plesiomonas shigelloides）的诊断。

2 规范性引用文件
下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。
GB/T 4789.28-2013 食品安全国家标准 食品微生物学检验 培养基和试剂的质量要求
GB/T 6682-2008 分析实验室用水规格和实验方法
GB/T 18652-2002 致病性嗜水气单胞菌检验方法
SC/T 7013-2008 水生动物产地检疫采样技术规范
SC/T 7014-2006 水生动物检疫实验技术规范
SC/T 7201.1-2006 鱼类细菌病检疫技术规程 第1部分：通用技术

3 术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。
3.1 鱼类志贺邻单胞菌病 (Plesiomonas shigelloides for sturgeon) 指由类志贺邻单胞菌（Plesiomonas shigelloides）感染引起达氏鲟和西伯利亚鲟发病或死亡的细菌性疾病。

4 试剂和材料
4.1 试剂、染色液和培养基
检验中所需试剂、染色液与培养基的配制按照GB/T 14785.2、GB/T 18652和SC/T 7014规定执行。Taq酶、dNTPs、10X PCR缓冲液（无Mg）、DNA分子量标准参照物应从专业试剂公司提供的商品化试剂中获取；微生物生化鉴定管可替代相应鉴定培养基或鉴定试剂，上述未提及的见附录A。
4.2 水
应符合GB/T 6682中一级水的规格。
4.3 引物
16S rRNA基因DNA序列扩增引物：P-F: 5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'，P-R: 5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'。

5 设备与器械
超净工作台、高压灭菌锅、恒温培养箱、高速冷冻离心机、水平电泳系统、凝胶成像系统、普通光学显微镜、PCR扩增仪、电子天平、微量移液器、普通冰箱、解剖盘、剪刀、镊子、手术刀、培养皿、铂耳丝、酒精灯等。

6 临床检查
6.1 临床症状
病鱼共同特征为反应迟钝，离群独游，游动迟缓或侧翻，摄食减少或停止摄食。
6.2 体表检查
体表外部检查参照SC/T 7201.1中6.2执行。病鱼鳍条基部不同程度的充血、出血；部分病鱼腹部膨大；极少病鱼无明显外部病变。
6.3 内脏检查
肝脏肿大充血、出血；部分病鱼肠道肠腔内有少量淡黄色的粘液，部分病鱼肠道无明显变化。

7 实验室样品采集
样品采集按SC/T 7013执行。

8 细菌分离与纯化
在无菌的环境中，用灭菌铂耳分别勾取病鱼的肝、肾，划线接种至LB固体培养基，28℃培育24-48小时，从中挑取圆形、隆起、光滑、边缘整齐的单个菌落在LB平板上进行纯化培养。LB培养基的配制方法见附录A。

9 细菌鉴定
9.1 革兰氏染色
参考GB/T 18652-2002中2.2.5规定进行。
9.2 生理生化试验
9.2.1 乙酰甲基甲醇（V-P）试验按SC/T 7014中表2的规定执行。有气泡产生为阳性，无气泡产生为阴性。
9.2.2 氧化酶试验
以毛细管吸取四甲基对二苯胺的1%水溶液滴在细菌的菌落上。菌落呈玫瑰红色、深紫色为阳性，不变色为阴性。