【农业行业标准(NY)】 禽流感病毒RT-PCR试验方法

ICS11.220
中华人民共和国农业行业标准
NY/T772—2004
禽流感病毒RT-PCR试验方法
2004-02-17发布
2004-02-17实施
中华人民共和国农业部发布
本标准山中华人民共和国农业部提出前言
本标准山全国动物检疫标准化技术委员会归门。本标准推荐了两种试验方法
本标准中附录A、附录C为规范性附录，附录B、附录D为资料性附录。本标准起草单位：中国农业科学院哈尔滨兽医研究所、农业部兽医诊断中心本标准主要起草人：王秀荣、孙明、刘明、王宏伟、陈化兰、刘丽玲NY/T772--2004
1范围
禽流感病毒RT一PCR试验方法（-）NY/T772—2004
本标准规定了禽流感病毒型特异性检测技术和禽流感病毒H5、H7、H9血凝素业型及N1、N2神经氨酸酶业型的RT-PCR鉴别技术。本标准适用于检测禽组织、分泌物、排泄物和鸡胚尿囊液中禽流感病毒核酸2规范性引用文件
下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款，凡是注期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准，GB/T18936高致病性禽流感诊断技术3实验室条件
3.1仪器：PCR仪、台式低温高速离心机、电泳仪、电泳槽、冰箱、手提紫外线灯、紫外凝胶成像仪、微量移液器、水浴箱等。
3.2从事RT-PCR工作的实验室尽可能分区，根据条件划分出RNA提取区、基因扩增区、电泳区。特别注意电泳后的琼脂糖凝胶要及时处理，避免对实验室造成污染3.3注意个人防护和环境保护，电泳小用到的EB可诱发基因突变试验中被EB污染的物品要有专用收集处，并通过楚烧进行无害化处理。4试剂的准备
4.1试剂
4.1.1变性液见A.1。
4.1.22M醋酸钠溶液（pH4.0)见A.24.1.3水饱和酚（pll4.0)。
4.1.4氯仿/异戊醇混合液见A.3
4.1.5M-MLV反转录酶（200u/uL）。4.1.6RNA酶抑制剂（40u/μL)
4.1.7TaqDNA聚合酶(5u/ul)。
81.0%琼脂糖凝胶见A.4
50XTAF缓冲液见A.5。
溴化乙锭（10μg/l）见A.6。
4.1.11加样缓冲液见A.7
4.1.12焦碳酸二乙酯（DEPC)处理的灭菌双蒸水见A.8。35×反转录反应缓冲液见A.9。
4.1.142.5mmoldNTPs见A.10
10xPCRBuffer见A.11
NY7T772--2004
6DVA分子量标准
4.2引物
见附录13
5操作程序
5.1样品的采集和处理
按照GB/T18936提供的方法进行。5.2RNA的提取
5.2.1设立阳性样品对照、阴性样品对照。5.2.2异硫氰酸胍一步法
5.2.2.1将组织或细胞中加人适的变性液，匀浆。5.2.2.2将混合物移至一管中，按每毫升变性液中立即加人0.1ml乙酸钠、1mL酚、0.2mL氯仿/异戊醇混合液。加入每种组分后，盖上管盖，倒置混匀。5.2.2.3将匀浆剧烈振荡10s，冰浴15min，使核蛋白质复合体彻底裂解，5.2.2.4然后12(000rpm.4C离心20min，将上层含RNA的水相移入新管中。为了降低被处于水相和有机相分界处的DNA污染的可能性，不要吸取水相的最下层。5.2.2.5加入等体积的异丙醇，充分混勾液体，并在-20℃条件下沉淀RV^1h或更长时间，5.2.2.64℃12000rpm离心10min，充上清，再用75%的乙醇洗涤沉淀；然后离心，再用吸头彻底吸弃上清，在自然条件下下燥沉淀，溶于适量DEPC处理的水中一20℃贮存，备用。5.2.3选择市售商品化RNA提取试剂盒，完成RNA的提取。5.3反转录
5.3.1取5μLRVA加1gL反转录引物，70℃5min5.3.2冰浴2min
5.3.3继续加入：
5×反转录反应缓冲液
2.5 mmol dNTPs
M-MLV反转录酶
R.VA酶抑制剂
DEPC水
37℃水浴1h，合成cDNA链。取出后，可以直接进行PCR，或者放于20℃保存备用。试验同时设立阳性对照和阴性对照。
根据扩增日的的不同，选择不同的上、下游引物，M-229U/M-229L是型特异性引物，用于扩增禽流感病毒的M基闪片段：H5-380U/H5-380L、H7-501U/H7-501L、H9732U/H9-732L分别特异性扩增H5、H7、II9亚型血凝素基因片段；NI-358U/N1-358L、N2377U/N2-377L分别特异性扩增N1、N2亚型神经氨酸酶基因片段、PCR为50uL体系，包括：
双蒸灭菌水
反转录产物
上游引物
下游引物
10 × PCR Buffer
2.5mmoldNTPs
Taq酶
NY/T772—2004
首先加入双蒸火菌水，然后再按照顺序逐一加人上述成分，每一次要加人到液面以下。全部加完后，混悬，瞬时离心，使液体都沉降到PCR管底。在每个PCR管中加人1滴液体石蜡（约20uL）。循环参数为95℃5min，94℃45s，52℃45s，72℃45s.循环30次72℃延伸6min结束。设立阳性对照和阴性对照。
5.5电泳
5.5.1制备1.0%琼脂糖凝胶板，见A.4。5.5.2取5μLPCR产物，与0.5μL加样缓冲液混合，加入琼脂糖凝胶板的加样孔中。5.5.3加入分子量标准。
5.5.4盖好电泳仪，插好电极，5V/cm电压电泳，30min40min。5.5.5在手提紫外线灯下观察；或者用紫外凝胶成像仪扫描图片存档，打印。5.5.6用分子量标准比较，判断PCR片段大小6结果判定
6.1在阳性对照出现相应大小扩增带、阴性对照无此带出现的情况下判定结果。6.2用M-229U/M-229L检测，出现大小约229bp扩增片段时，判定为离流感病毒阳性，否则判定为阴性。
6.3用H5-380U/H5-380L检测，出现大小约380bp扩增片段时，判定为H5血凝素亚型禽流感病毒阳性，否则判定为阴性。
6.4用H7-501C/H7-501L检测，出现大小约501bp扩增片段时，判定为H7血凝素亚型禽流感病毒阳性，否则判定为阴性。
6.5用H9-732U/H9-7321.检测，出现大小约732bp扩增片段时，判定为H9血凝素亚型禽流感病毒阳性，否则判定为阴性。
6.6用NI-358U/N1-3581.检测，出现大小约358bp扩增片段时，判定为N1神经氨酸酶亚型禽流感病毒阳性，否则判定为阴性。6.7用N2-377U/N2-377L检测，出现大小约377bp扩增片段时，判定为N2神经氨酸酶亚型禽流感病毒阳性，否则判定为阴性。3
NY/T772—2004
1范围
禽流感病毒RT一PCR试验方法（二）本标准规定了禽流感病毒型特异性检测技术和禽流感病毒H5、H7、H9血凝素业型的反转录聚合酶链反应(RT-PCR)鉴别诊断技术本标准适用于检测禽组织、分泌物、排泄物利鸡胚尿囊液中禽流感病毒核酸2试剂
2.1变性液见C.1。
2.22mol/L.醋酸钠溶液（pH4.0)见C.22.3酚/氯仿/异戊醇混合液见C.32.42.5mmol/LdNTP见C.4
2.510×PCR缓冲液见C.5
2.6溴化乙锭(EB)溶液见C.6。
2.7TAE电泳缓冲液见C.7。
2.82%琼脂糖凝胶见C.8。
2.9上样缓冲液见C.9。
2.1010pmol/uLRT-PCR引物见附录D2.11其他试剂：5uTagDNA聚合酶，10u/LAMV反转录酶，40μ/L，RNA酶抑制剂，异内醇，70%乙醇，
3实验室条件
实验室应配备的仪器
分析天平、台式冷冻高速离心机、真空干燥器、制冰机、PCR扩增仪、电泳仪、电冰槽、紫外凝胶成像仪（或紫外分析仪）、液氮罐或70℃冰箱、微波炉、组织研磨器、-20℃冰箱、可调移液器（2αL、20μL、200μL、1000μL)
3.2实验室分区
PCR整个试验分PCR反应液配制区一配液区、模板提取区、扩增区、电泳区，流程顺序为配液区◆模板提取区扩增区电区。严禁器材和试剂倒流。4操作程序
4.1样品的采集及处理
4.1.1样品的采集
病死或扑杀禽，取脑、肺等组织；待检活禽，用棉拭子蘸取气管分泌物或泄殖腔排泄物，放于50%甘油生理盐水中（要求送检病料新鲜，严禁反复冻融病料)4.1.2样品的处理
4.1.2.1组织样品处理
称取待检病料0.05g，置于研磨器中剪碎并研磨，加人600l，变性液继续研磨。取已研磨好的待4
检病料上清300L置于1.5mL灭菌离心管中，加人100L变性液，混勺4.1.2.2分泌物和排泄物样品处理NY/T772—2004
将棉拭子充分捻动、柠F后弃去拭子。48000rpm离心5min.取上清100uL，置于1.5mlL灭菌离心管中，加人300uL变性液，混匀。4.1.2.3阳性对照处理
取离流感病毒液100L，置于1.5mL灭菌离心管巾，加人300l变性液，混匀4.1.2.4阴性对照处理
取火菌双蒸水100l，置于1.5mL灭菌离心管中，加入300l.变性液.混匀，4.2病毒R.VA的提取
4.2.1取已处理的待检样品以及阴性对照、阳性对照，每管依次加入醋酸钠溶液30u1.酚/氯仿/异戊醇混合液300L，颠倒10次混勾，冰浴15min，4℃10000rpm离心15mino4.2.2取上清300uL置于新的经IDEPC水处理过的1.5mL灭菌离心管中，加入等体积异内醇，混匀，置于液氮中3min或-70℃冰箱20min，取出样品管，室温融化，4℃15000rpm离心20min：4.2.3弃上清，沿管壁缓缓滴入1mL70%乙醇，轻轻旋转洗次后倒掉，将离心管倒扣于吸水纸1.1min，真空干燥15min。
4.2.4用10uL无RNA酶的灭菌双蒸水和1LRAA酶抑制剂溶解沉淀。一20℃储存备用。4.3RT-PCR
4.3.1引物选用
4.3.1.1型特异性引物用J检测禽流感病毒核蛋白基因(.VP)片段4.3.1.2H5亚型引物用于检测禽流感病毒II5亚型血凝素基因(HA)片段4.3.1.3H7亚型引物用于检测禽流感病毒H7亚型血凝素基因(HA)片段。4.3.1.4H9业型引物用于检测禽流感病毒H9亚型血凝素基因(HA)片段。4.3.2反应体系
本试验为反转录和PCR扩增同时进行，反应液总体积为25μlDEPC处理的灭菌双蒸水
2.5 mmol/L dNTP
10pmol/μLRT-PCR引物
15mrrnol/L氯化镁
10×PCR缓冲液
AMV反转录酶
RNA酶抑制剂
SuTagDVA聚合酶
提取的样品RNA
0.3μL，
混匀并做好标记，加人20L矿物油覆盖，在PCR扩增仪上进行以下循环：42C45rnin，95℃3min扩增条件为95℃30s，50℃40s（用型特异性引物时，为55℃40s），72℃40s，35个循环后.72℃延伸10 min。
4.4电泳
取PCR扩增产物15μL与3L1.样缓冲液混合，点样于2%琼脂糖凝胶孔中，以5V/cm电压进行电泳，40min，紫外凝胶成像仪或紫外分析仪上观察结果。5结果判定
5.1在阳性对照出现相应大小扩增带、阴性对照无带此出现的情况下判定结果。5
NY/T 7722004
2用型特异引物检测被检样品出现330bp条带时，判定为禽流感病毒阳性，否则为阴性。5.2
3用H5亚型引物检测被检样品出现545bp条带时，判定为H5亚型禽流感病毒阳性，否则为阴性。5.3
用H7亚型引物检测被检样品出现634bp条带时，判定为H7亚型禽流感病毒阳性，否则为阴性。5.4月
用H9亚型引物检测被检样品出现488bp条带时，判定为H9亚型禽流感病毒阳性，否则为阴性。A.1变性液
4M异硫氰酸胍
25tmM柠檬酸钠·2HO
0.5%（m/V）十二烷基肌酸钠
0.1Mβ-巯基乙醇
附录A
（规范性附录）
相关试剂的配制
NY/T772—2004
具体配制：将250g异硫氰酸胍、0.75M（pH7.0）柠檬酸钠17.6mL和26.4mL10%（m/V）十二烷基肌酸钠溶于293mL水中。65℃条件下搅拌、混勾，直至完全溶解。室温条件下保存，每次临用前按每50ml变性液加入14.4mol/L的3-筑基乙醇0.36mL的剂量加人。变性液可在室温下避光保存数月。
A.22mol/L乙酸钠溶液（pH4.0）乙酸钠
冰乙酸
灭菌双蒸水
A.3氯仿/异戊醇混合液
异戊醇
41.0%琼脂糖凝胶的配制
琼脂糖
0.5×TAE电泳缓冲液
调pH至4.0
加至100mL
加至100ml
微波炉中完全融化，待冷至50℃60℃时，加溴化乙锭（EB)溶液5L，摇匀，倒人电泳板上，凝固后取下梳子，备用。
A.550×TAE电泳缓冲液
A.5.10.5mol/L乙二铵四乙酸二钠（EDTA）溶液（pH8.0）二水乙一铵四乙酸一钠
火菌双蒸水
氢氧化钠
火菌双蒸水
TAE电泳缓冲液（50×）配制
羟基甲基氨基甲烷(Tris)
冰乙酸
0.5mol/l.乙二铵四乙酸二钠溶液（pH8.0）灭菌双蒸水
调pH至8.0
加至100mL
加至1000ml
NY/T772—2004
用时用灭菌双蒸水稀释使用
A.6溴化乙锭（EB)溶液
溴化乙锭
灭菌双蒸水
A.710×加样缓冲液
聚蔗糖
灭菌双蒸水
溴酚蓝
二甲苯睛
DEPC水
超纯水
焦碳酸二乙酯（DEPC）
加至20ml
室温过夜，121℃高压15min，分装到1.5mLDEPC处理过的微量管中。A.9M-MLV反转录酶5×反应缓冲液1moLTris-HCI(pH8.3)
灭菌双蒸水
2.5mmol/LdNTP
DATP(10 mmol/L)
DTTP(10mmol/L)
DGTP(10 mmol/L)
DCTP(10 mmol/L)
10×PCR缓冲液
1M Tris -HCI (pH8.8)
NonidetP40
1.5mo.MgClz
火菌双蒸水
加至100mL
20 μl
20 μL
加至100mL
B.1反转录引物
附录B
（资料性附录）
禽流感病毒RT-PCR试验用引物
Uni12：5-AGCAAAAGCAGG-3°，引物浓度为20pmol。PCR引物
见表B.1，引物浓度均为20pmol。表B.1
引物名称此内容来自标准下载网
M-229U
M-2291
115-380U
H5-380L
H7-501U
H7-501L
H9-732U
1I9732L
NI-358U
NI-358L
N2-377U
N2-377L
PCR过程中选择的引物
引物序列
5-TTCTAACUGAGGICGAAAC-3
5-AAGCGTCTACGCTGCAGTCC3
5'-AGTGAATTGGAATATGGTAACTG-35'-AACTGAGTGTICATTTTGTCAAT-35'-AATGCACARGGAGGAGGAACT3\
5-TGAYGIGAAGCTAAACCA--3
5-TCAACAAACTCCACCGAAACTGT-3
5'-TCCCGTAAGAACATGTCCATACCA-35'-ATTRAAATACAAYGGYATAATAAC-3'5'-GTCWCCGAAAACYCCACTGCA3\
5'-GTGTGYATAGCATGICCAGCTCAAG-3S
GAGCCYTTCCARTTGTCTCTGCA-3
注:W =(AT):Y =(CT):R =(AG)
NY/T772—2004
扩增目的
通用引物
NY/T7722004
C.1变性液
柠檬酸钠
十二烷基肌氨酸钠
β硫基乙醇
硫氰酸胍
灭菌双蒸水
2mol/l，乙酸钠溶液（pH4.0)
乙酸钠
冰乙酸
火菌双蒸水
酚/氯仿/异戊醇混合液
酸性酚
异戊醇
C.42.5mmol/L.dNTP
dATP(100 mmol/L)
dTTP(100 mmol/L)
dGTP(100 mmol/L)
dCIP(100 mmol/L)
灭菌双蒸水
510×PCR缓冲液
火菌双蒸水
三羟甲基氨基甲烷(Tris）
氯化钾
曲拉通X-100
灭菌双蒸水
6溴化乙锭（FB）溶液
溴化乙锭
灭菌双蒸水
TAE电泳缓冲液（50×）
附录C
（规范性附录）
试剂的配制
0.5mol/L乙二铵四乙酸二钠（EDTA）溶液（pH8.0）0.764g
加至100ml
加至100mL
20 μL
20 μt
加至800l
调pH至9.0
加至100ml
加至20mL
小提示：此标准内容仅展示完整标准里的部分截取内容，若需要完整标准请到上方自行免费下载完整标准文档。