【国家标准(GB)】 食品卫生微生物学检验 染色法、培养基和试剂

中华人民共和国国家标准
食品卫生微生物学检验
染色法、培养基和试剂
Microbiological examination of food hygieneStainning methods,culture mediums and reagents主题内容与适用范围
本标准规定了各种染色法、培养基和试剂。本标准适用于食品和食物中毒样品中各类微生物的检验。染色液配制及染色法
2.1美蓝染色法
2.1.1吕氏碱性美蓝染色液
95%乙醇
0.01%氢氧化钾溶液
将美蓝溶解于乙醇中,然后与氢氧化钾溶液混合。2.1.2染色法
GB4789.28-94
代替GB4789.28-84
将涂片在火焰上固定待冷。滴加染液,染1～3min,水洗,待干，镜检。2.1.3结果
菌体呈蓝色。
2.2革兰氏染色法
2.2.1结晶紫染色液
结晶紫
95%乙醇
1%草酸铵水溶液
将结晶紫溶解于乙醇中,然后与草酸铵溶液混合。2.2.2革兰氏碘液
碘化钾
蒸馏水
将碘与碘化钾先进行混合，加入蒸馏水少许,充分振摇，待完全溶解后，再加蒸馏水至300mL。
2.2.3沙黄复染液
95%乙醇
蒸馏水
将沙黄溶解于乙醇中,然后用蒸馏水稀释。2.2.4：染色法
2.2.4.1将涂片在火焰上固定，滴加结晶紫染色液，染1min,水洗。2.2.4.2滴加革兰氏碘液，作用1min,水洗。2.2.4.3滴加95%乙醇脱色，约30s；或将乙醇滴满整个涂片，立即倾去，再用乙醇滴满整个涂片,脱色10s。
2.2.4.4水洗，滴加复染液，复染1min。水洗，待干，镜检。2.2.5结果
革兰氏阳性菌呈紫色。革兰氏阴性菌呈红色。注：亦可用1：10稀释石炭酸复红染色液作复染液，复染时间仅需10s。2.3耐酸性染色法（姜一倪二氏法）2.3.1石炭酸品红染色液
碱性品红
95%乙醇
5%酚水溶液
将品红溶解于乙醇中,然后与酚溶液混合。2.3.23%盐酸一乙醇
浓盐酸
95%乙醇
2.3.3复染液
吕氏碱性美蓝染色液。
2.3.4染色法
2.3.4.1将涂片在火焰上加热固定，滴加石炭酸品红染色液，徐徐加热至有蒸气出现，但切不可使沸腾。染液如因发减少时，应随时添加。染5min.倾去染液，水洗。2.3.4.2滴加盐酸一乙醇脱色，直至无红色脱落为止(所需时间视涂片厚薄而定，一般为1~3min),水洗。
2.3.4.3滴加吕氏碱性美蓝染色液，复染30s~1min,水洗，待干，镜检。2.3.5结果：耐酸性细菌呈红色,其他细菌、细胞等物质呈蓝色。2.4柯氏染色法
2.4.1染色液
2.4.1.10.5%沙黄液。
2.4.1.20.5%孔雀绿液。
2.4.2染色法
2.4.2.1将涂片在火焰上固定，滴加0.5%沙黄液，并加热至出现气泡，约2~3min,水洗。2.4.2.2滴加0.5%孔雀绿液，复染40～50s。水洗，待干，镜检。2.4.3结果
布氏杆菌呈红色,其他细菌及细胞呈绿色。2.5奥尔特氏荚膜染色法
2.5.1染色液
蒸馏水
用乳钵研磨溶解。
2.5.2染色法
将涂片在火焰上固定，滴加染色液，并加热至产生蒸气后继续染3min。水洗，待干，镜检。
2.5.3结果
炭疽芽胞杆菌菌体呈赤褐色，荚膜呈黄色。2.6瑞氏染色法
2.6.1染色液
瑞氏色素
用乳钵研磨溶解。
2.6.2染色法
2.6.2.1涂片待自然干燥后，滴加染色液，固定1min。2.6.2.2加入等量蒸馏水(pH6.5),染色3~5min。2.6.2.3用蒸馏水冲洗待干，镜检。2.7鞭毛染色法
2.7.1染色液的配制
2.7.1.1甲液：称丹宁酸5g、氯化高铁(FeC13)1.5g,溶于100mL蒸馏水中，待溶解后加入1%的氢氧化钠溶液1mL和15%的甲醛溶液2mL。2.7.1.2乙液：称2g硝酸银溶于100mL蒸馏水中。在90mL乙液中滴加浓氢氧化铵溶液,到出现沉淀后，再滴加使其变为澄清，然后用其余10mL乙液小心滴加至澄清液中，至出现轻微雾状为止（此为关键性操作,应特别小心）。滴加氢氧化铵和用剩余乙液回滴时.要边滴边充分摇荡，染液当天配，当天使用，2～3d基本无效。
2.7.2染色法
在风干的载玻片上滴加甲液，4～6min后,用蒸馏水轻轻冲净。再加乙液,缓缓加热至冒汽，维持约半分钟（加热时注意勿使出现干燥面）。在菌体多的部位可皇深褐色到黑色，停正加热，用水冲净，干后镜检.菌体及鞭毛为深褐色到黑色。2.8碱性复红染色法
将0.5g碱性复红染料溶解于20mL95%乙醇中，然后用蒸馅水稀释至100mL。如有不溶物时，可用滤纸过滤,或静置后取上清液备用。注：本染色液系用于苏云金芽胞内蛋白质毒素结晶的染色，藉以与蜡样芽胞杆菌相区别。
3生化试验培养基和试剂
3.1Hugh-Leifson培养基(O/F试验用）3.1.1成分
蛋白陈
氯化钠
磷酸氢二钾
葡萄糖
0.2%溴麝香草酚蓝溶液
蒸馏水
3.1.2制法
1000mL
将蛋白陈和盐类加水溶解后,校正pH至7.2。加入葡萄糖、琼脂煮沸,溶化琼脂,然后加入指示剂。混匀后，分装试管，121℃高压灭菌15min,直立凝固备用。3.1.3试验方法
从斜面上挑取小量培养物作穿刺接种，同时接种两支培养基,其中一支于接种后滴加溶化的1%琼脂液于表面，高度约1cm，于36土1℃培养。3.1.4、结果
反应类型
封口的培养基
开口的培养基
发酵型(F)
氧化型(O)
产碱型(A)
3.2糖发酵管
3.2.1成分
牛肉膏
蛋白陈
氯化钠
磷酸氢二钠（Na2HPO4·12H2O)
0.2%溴麝香草酚蓝溶液
蒸馏水
3.2.2制法
1000mL
3.2.2.1葡萄糖发酵管按上述成分配好后，按0.5%加入葡萄糖，分装于有一个倒置小管的小试管内.121℃高压灭菌15min。3.2.2.2其他各种糖发酵管可按上述成分配好后，分装每瓶100mL,121℃高压灭菌15min。另将各种糖类分别配好10%溶液，同时高压灭菌。将5mL糖溶液加入于100mL培养基内，以无菌操作分装小试管。
注：蔗糖不纯，加热后会自行水解者，应采用过滤法除菌。3.2.3试验方法：从琼脂斜面上挑取小量培养物接种，于36土1℃培养，一般观察23d。迟缓反应需观察14～30d。
3.3ONPG培养基
3.3.1成分
邻硝基酚β-D-半乳糖苷(ONPG)
(O-Nitrophenyl-β-D-galactopyranoside)0.01mol/L磷酸钠缓冲液(pH7.5)1%蛋白陈水(pH7.5)
3.3.2制法
将ONPG溶于缓冲液内,加入蛋白陈水,以过滤法除菌,分装于10mm×75mm试管,每管0.5mL,用橡皮塞塞紧。
3.3.3试验方法
自琼脂斜面上挑取培养物1满环接种，于36士1℃培养13h和24h观察结果。如果β-半乳糖苷酶产生,则于1～3h变黄色,如无此酸则24h不变色。3.4缓冲葡萄糖蛋白陈水(MR和VP试验用）3.4.1成分
磷酸氢二钾
葡萄糖
蒸馏水
3.4.2制法
1000mL
溶化后校正pH,分装试管，每管1mL，121℃高压灭菌15min。3.4.3甲基红(MR)试验
自琼脂斜面挑取少量培养物接种本培养基中，于36土1℃培养2～5d,哈夫尼亚菌则应在22～25℃培养。滴加甲基红试剂一滴，立即观察结果。鲜红色为阳性，黄色为阴性。甲基红试剂配法：10mg甲基红溶于30mL95%乙醇中，然后加入20mL蒸馏水。3.4.4V-P试验
用琼脂培养物接种本培养基中，于36士1℃培养2～4d。哈夫尼亚菌则应在22～25℃培养。加入6%α-萘酚-乙醇溶液0.5mL和40%氢氧化钾溶液0.2mL，充分振摇试管，观察结果。阳性
反应立刻或于数分钟内出现红色,如为阴性,应放在36土1℃下培养4h再进行观察。3.5西蒙氏柠檬酸盐培养基
3.5.1成分
氯化钠
硫酸镁(MgS04·7H2O）
磷酸二氢铵
磷酸氢二钾
柠檬酸钠
蒸馏水
0.2%溴麝香草酚蓝溶液
3.5.2制法
1000mL
先将盐类溶解于水内,校正pH,再加琼脂,加热溶化。然后加入指示剂,混合均匀后分装试管121℃c高压灭菌15min。放成斜面。3.5.3试验方法
挑取少量琼脂培养物接种,于36土1℃培养4d,每天观察结果。阳性者斜面上有菌落生长,培养基从绿色转为蓝色。
3.6克氏柠檬酸盐培养基
3.6.1成分
柠檬酸钠
葡萄糖
酵母浸膏
单盐酸半胱氨酸
磷酸二氢钾
氯化钠
0.2%酚红溶液
蒸馏水
3.6.2制法
1000mL
加热溶解，分装试管，121℃高压灭菌15min。放成斜面。3.6.3试验方法
用琼脂培养物接种整个斜面,在36士1℃培养7d,每天观察结果。阳性者培养基变为红色。
3.7丙二酸钠培养基
3.7.1成分
酵母浸膏
硫酸铵
磷酸氢二钾
磷酸二氢钾
氯化钠
丙二酸钠
0.2%溴麝香草酚蓝溶液
蒸馏水
3.7.2、制法
1000mL
先将酵母浸膏和盐类溶解于水,校正pH后再加入指示剂,分装试管，121℃高压灭菌15min。
3.7.3试验方法
用新鲜的琼脂培养物接种，于36土1℃培养48h,观察结果。阳性者由绿色变为蓝色。3.8葡萄糖铵培养基
3.8.1成分
氯化钠
硫酸镁(MgSO4·7H20)
磷酸二氢铵
磷酸氢二钾
葡萄糖
蒸馏水
0.2%溴麝香草酚蓝溶液
3.8.2制法
1000mL
先将盐类和糖溶解于水内校正pH.再加琼脂加热溶化.然后加入指示剂混合均匀后分装试管，121℃高压灭菌15min,放成斜面。3.8.3试验方法
用接种针轻轻触及培养物的表面,在盐水管内做成极稀的悬液，肉眼观察不见混浊，以每一接种环内含菌数在20～100之间为宜。将接种环灭菌后挑取菌液接种.同时再以同法接种普通斜面一支作为对照。于36土1℃培养24h。阳性者葡萄糖铵斜面上有正常大小的菌落生长；阴性者不生长,但在对照培养基上生长良好。如在葡萄糖铵斜面生长极微小的菌落可视为阴性结果。
注：容器使用前应用清洁液浸泡。再用清水、蒸馏水冲洗干净，并用新棉花做成棉塞，干热灭菌后使用。如果操作时不注意，有杂质污染时，易造成假阳性的结果。3.9马尿酸钠培养基
3.9.1成分
马尿酸钠
肉浸液
3.9.2制法
将马尿酸钠溶解于肉浸液内,分装于小试管内,并于管壁画一横线。以标志管内液面高度，高压灭菌121℃20min。
3.9.3试剂
三氯化铁(FeCI3·6H20)12g,溶于2%盐酸溶液100mL中即成。3.9.4、试验方法
用纯培养物接种,于42℃培养48h,观察培养液是否到达试管壁上记号处,如不足时，用蒸留水补足至原量。经离心沉淀.吸取上清液0.8mL.加入三氯化铁试剂0.2mL立即混合均匀,经10~15min,观察结果。3.9.5结果：出现恒久之沉淀物为阳性。3.10营养明胶
3.10.1成分
蛋白陈
牛肉膏
蒸馏水
3.10.2制法
pH6.8~7.0
1000mL
加热溶解、校正至pH7.4～7.6,分装小管，121℃高压灭菌10min，取出后迅速冷却，使其凝固。复查最终pH应为6.8～7.0。3.10.3试验方法
用琼脂培养物穿刺接种，放在22～25℃培养，每天观察结果.记录液化时间。或放在36士1℃培养.每天取出，放冰箱内30min后再观察结果。3.11苯丙氨酸培养基
3.11.1成分
酵母浸膏
DI-苯丙氨酸(或L-苯丙氨酸1g)
磷酸氢二钠
氯化钠
蒸馏水
3.11.2制法
1000mL
加热溶解后分装试管，121℃高压灭菌15min，使成斜面。3.11.3试验方法
自琼脂斜面上挑取大量培养物,移种于苯丙氨酸琼脂,在36土1℃培养4h或18～24h。滴加10%三氯化铁溶液2~3滴自斜面培养物上流下苯丙氨酸脱氨酶阳性者呈深绿色3.12氨基酸脱羧酶试验培养基
3.12.1成分
蛋白陈
酵母浸膏
葡萄糖
蒸馏水
1.6%溴甲酚紫-乙醇溶液
L-氨基酸或 DL-氨基酸
3.12.2制法
1000mL
0.5或1g/100ml
除氨基酸以外的成分加热溶解后,分装每瓶100mL,分别加入各种氨基酸：赖氨酸、精氨酸和鸟氨酸。L-氨基酸按0.5%加入,DL-氨基酸按1%加入。再行校正pH至6.8。对照培养基不加氨基酸。分装于灭菌的小试管内.每管0.5mL上面滴加一层液体石蜡115℃高压灭菌10min。
3.12.3试验方法
从琼脂斜面上挑取培养物接种，于36土1℃培养18～24h,观察结果。氨基酸脱羧酶阳性者由于产碱,培养基应呈紫色。阴性者无碱性产物,但因葡萄糖产酸而使培养基变为黄色。对照管应为黄色。
3.13蛋白陈水(靛基质试验用）
3.13.1成分
蛋白陈(或胰蛋白陈)
氯化钠
蒸馏水
3.13.2制法
1000mL
按上述成分配制，分装小试管，121℃高压灭菌15min。3.13.3靛基质试剂
3.13.3.1柯凡克试剂：将5g对二甲氨基苯甲醛溶解于75mL戊醇中。然后缓慢加入浓盐酸25mL。
3.13.3.2欧-波试剂：将1g对二甲氨基苯甲醛溶解于95mL95%乙醇内。然后缓慢加入浓盐酸20mL。
3.13.4试验方法
挑取小量培养物接种，在36士1℃培养1～2d,必要时可培养4～5d。加入柯凡克试剂约0.5mL,轻摇试管，阳性者于试剂层呈深红色；或加入欧-波试剂约0.5mL,沿管壁流下，覆盖于培养液表面.阳性者于液面接触处皇玫瑰红色。注：蛋白陈中应含有丰富的色氨酸。每批蛋白陈买来后,应先用已知菌种鉴定后方可使用。
3.14硫酸亚铁琼脂(硫化氢试验用）3.14.1成分
牛肉膏
酵母浸膏
蛋白陈
硫酸亚铁
硫代硫酸钠
氯化钠
蒸馏水
3.14.2制法
1000mL
加热溶解，校正pH,分装试管,115℃高压灭菌15min,取出直立侯其凝固。3.14.3试验方法
挑取琼脂培养物,沿管壁穿刺,于36土1℃培养1～2d,观察结果。产硫化氢者使培养基变为黑色。
注：肠杆菌科细菌测定硫化氢的产生,应采用三糖铁琼脂或本培养基。3.15尿素琼脂
3.15.1成分
蛋白陈
氯化钠
葡萄糖
磷酸二氢钾
0.4%酚红溶液
蒸馏水
20%尿素溶液
pH7.2±0.1
3.15.2制法
1000mL
将除尿素和琼脂以外的成分配好,并校正pH,加入琼脂,加热溶化并分装烧瓶。121℃高压灭菌15min。冷至50～55℃,加入经除菌过滤的尿素溶液。尿素的最终浓度为2%最终pH应为7.2土0.1。分装于灭菌试管内,放成斜面备用。3.15.3试验方法
挑取琼脂培养物接种,在36土1℃培养24h,观察结果,尿素酶阳性者由于产碱而使培养基变为红色。
3.16氰化钾(KCN)培养基
3.16.1成分
蛋白陈
氯化钠
磷酸二氢钾
磷酸氢二钠
蒸馏水
0.5%氰化钾溶液
3.16.2制法
1000mL
将除氟化钾以外的成分配好后分装烧瓶，121℃高压灭菌15min。放在冰箱内使其充分冷却。每100mL培养基加入0.5%氰化钾溶液2.0mL(最后浓度为1：10000),分装于12mmX100mm灭菌试管，每管约4mL，立刻用灭菌橡皮塞塞紧，放在4℃冰箱内，至少可保存两个月。同时,将不加氰化钾的培养基作为对照培养基,分装试管备用。3.16.3试验方法
将琼脂培养物接种于蛋白陈水内成为稀释菌液.挑取1环接种于氰化钾(KCN)培养基。并另挑取1环接种于对照培养基。在36士1℃培养12d,观察结果。如有细菌生长即为阳性(不抑制),经2d细菌不生长为阴性(抑制)。注：氰化钾是剧毒药物，使用时应小心,切勿沾染，以免中毒。夏天分装培养基应在冰箱内进行。试验失败的主要原因是封口不严，氟化钾逐渐分解，产生氢氰酸气体逸出，以致药物浓度降低，细菌生长，因而造成假阳性反应。试验时对每一环节都要特别注意。
3.17硝酸盐培养基
3.17.1成分
硝酸钾
蒸馏水
1000mL
3.17.2制法
溶解，校正pH,分装试管,每管约5mL,121℃高压灭菌15min。3.17.3硝酸盐还原试剂
3.17.3.1甲液：将对氨基苯磺酸0.8g溶解于2.5mol/L乙酸溶液100mL中。3.17.3.2乙液：将甲萘胺0.5g溶解于2.5mol/L乙酸溶液100mL中。3.17.4试验方法
接种后在36土1℃培养1～4d,加入甲液和乙液各一滴，观察结果。硝酸盐还原为亚硝酸盐时于立刻或数分钟内显红色。注：本试验阴性的原因有三：细菌不能还原硝酸盐；亚硝酸盐继续分解，生成氨和氮；培养基不适于细菌的生长。如欲检查培养基中硝酸盐是否未被分解.可再加入锌粉少许，可使硝酸盐还原为亚硝酸盐而呈现红色。3.18氧化酶试验
3.18.1试剂
3.18.1.11%盐酸二甲基对苯二胺溶液：少量新鲜配制于冰箱内避光保存。3.18.1.21%α-酚-乙醇溶液。
3.18.2试验方法
3.18.2.1取白色洁净滤纸沾取菌落。加盐酸二甲基对苯二胺溶液一滴,阳性者呈现粉红色,并逐渐加深；再加α-萘酚溶液一滴，阳性者于半分钟内呈现鲜蓝色。阴性于两分钟内不变色。
以毛细吸管吸取试剂直接滴加于菌落上，其显色反应与以上相同。3.19细胞色素氧化酶试验
3.19.1试剂
3.19.1.11%盐酸二甲基对苯二胺溶液。3.19.1.21%α-萘酚-乙醇溶液。3.19.2试验方法
取37℃(或低于37℃)培养20h的斜面培养物一支，将两种试剂各2～3滴，从斜面上端滴下，并将斜面略加倾斜，使试剂混合液流经斜面上的培养物。如系平板培养物，则可用试剂混合液滴在菌落上。
3.19.3结果
于2min内呈现蓝色者为阳性。阳性培养物大多数于半分钟内出现强阳性反应,2min以后出现微弱或可疑反应均作为阴性结果。3.20过氧化氢酶试验
3.20.1试剂
3%过氧化氢溶液：临用时配制。3.20.2试验方法
挑取固体培养基上菌落一接种环，置于洁净试管内，滴加3%过氧化氢溶液2mL,观察结果。
3.20.3结果
于半分钟内发生气泡者为阳性,不发生气泡者为阴性。3.21过氧化物酶试验
3.21.1试剂
3.21.1.12%儿茶酚溶液。
3.21.1.23%过氧化氢溶液。
3.21.2试验方法
挑取固体培养基上菌落一接种环，置于洁净试管内，滴加2%儿茶酚溶液1mL及3%过氧化氢溶液1mL。静置于室温(20℃)中30～60min,观察结果。3.21.3结果
阳性反应,细菌变为黑褐色；阴性反应,细菌不变色。注：过氧化物酶的作用可受氰化钾的抑制。3.22磷酸盐缓冲液
3.22.1储存液
磷酸二氢钾
1mol/L氢氧化钠溶液
蒸馏水
3.22.2制法
先将磷酸盐溶解于500mL蒸馏水中，用1mol/L氢氧化钠溶液校正pH后，再用蒸馏水稀释
至1000mL。
3.22.3稀释液：取储存液1.25mL，用蒸馏水稀释至1000mL。分装每瓶100mL或每管10mL121℃高压灭菌15min。
3.23明胶磷酸盐缓冲液
3.23.1成分
磷酸氢二钠
蒸馏水
3.23.2制法
1000mL
加热溶解，校正pH,121℃高压灭菌15min。3.24乳酸一苯酚溶液
3.24.1成分
乳酸（比重1.21)
蒸馏水
3.24.2制法
将苯酚在水中加热溶解,然后加入乳酸及甘油。3.24.3用途免费标准bzxz.net
检验真菌形态时用。
4一般培养基和专用培养基
4.1肉浸液肉汤
4.1.1成分
绞碎牛肉
氯化钠
蛋白陈
磷酸氢二钾
蒸馏水
4.1.2制法
1000mL
将绞碎之去筋膜无油脂牛肉500g加蒸馏水1000mL.混合后放冰箱过夜.除去液面之浮油，隔水煮沸半小时，使肉渣完全凝结成块,用绒布过滤,并挤压收集全部滤液,加水补足原量。加入蛋白陈、氯化钠和磷酸盐，溶解后校正pH7.4～7.6煮沸并过滤,分装烧瓶，121℃高压灭菌30min。
4.2肉浸液琼脂
4.2.1成分
肉浸液肉汤(pH7.4)
4.2.2制法
1000mL
17~20g
加热溶化琼脂,分装烧瓶或试管,121℃高压灭菌30min。根据需要，倾注平板或放成斜面。
4.3牛肉(或牛心)消化汤
4.3.1成分
绞碎牛肉(或牛心)
15%氢氧化钠溶液
胰蛋白酶
三氯甲烷
氯化钠
蒸馏水
2000mL
4.3.2.1称取碎牛肉，加蒸馏水，隔水加热到80℃,维持15min。加氢氧化钠溶液,对pH试纸呈弱碱性,冷至40℃。4.3.2.2
加胰蛋白酶、氯仿.在36士1℃放置4～5h，每小时摇动一二次。4.3.2.44h后，吸取上层液5mL于试管中，加5%硫酸铜溶液0.1mL、4%氢氧化钠溶液5mL，混合之。若呈红色，则不须再消化，可由温箱取出。4.3.2.5加入15%乙酸溶液45mL,对pH试纸呈酸性。4.3.2.6
煮沸15min.使胰蛋白酶破坏.冷后.放冰箱内一夜。4.3.2.7
次日吸取上层清液.加氯化钠10g，并加水补足原量.煮沸。校正pH7.4~7.6(加15%氢氧化钠溶液约10mL),加热,用滤纸过滤，分装烧瓶，4.3.2.8
121℃高压灭菌20min。
注：①此培养基可作为琼脂培养基的基础,不需加蛋白陈。②胰蛋白酶之配制：称取去脂绞碎的猪胰500g.加入乙醇500mL、蒸馏水1500mL混合之,装入玻塞瓶内。每日摇匀三次。3d后,用绒布过滤挤出其汁,加盐酸至0.05%,放冰箱内保存备用。
4.4血消化汤
4.4.1成分
绞碎猪胃
绞碎猪血块
蒸馏水
浓盐酸
4.4.2制法
1000mL
4.4.2.1洗涤猪胃,除去油脂,保留胃粘膜,用绞肉机绞碎。2用绞肉机将猪血块绞碎。
4.4.2.3将蒸馏水加热至55℃,加入猪胃、猪血块和盐酸，置55℃水浴中24h,时常加以
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