【地方标准】 规模化牛场气溶胶中口蹄疫病毒、牛病毒性腹泻病毒和牛传染性鼻气管炎病毒实时荧光定量RT-PCRPCR检测技术规程

DB37/T4460—2021
规模化牛场气溶胶中口蹄疫病毒、牛病毒性腹泻病毒和牛传染性鼻气管炎病毒实时荧光定量RT-PCR/PCR检测技术规程
Real-time fluorescence quantitative RT-PCR/PCR detection technique for foot-and-mouth disease virus, bovine viral diarrhea virus and infectious bovine rhinotracheitis virus in aerosol of large-scale cattle farms
2021-12-27 发布
2022-01-27 实施
发布单位：山东省市场监督管理局

前言
本文件按照 GB/T 1.1—2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。
请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。
本文件由山东省畜牧兽医局提出并组织实施。
本文件由山东省畜牧业标准化技术委员会归口。

DB37/T4460—2021
规模化牛场气溶胶中口蹄疫病毒、牛病毒性腹泻病毒和牛传染性鼻气管炎病毒实时荧光定量RT-PCR/PCR检测技术规程

1 范围
本文件规定了规模化牛场气溶胶中口蹄疫病毒、牛病毒性腹泻病毒、牛传染性鼻气管炎病毒荧光定量RT-PCR/PCR检测技术。
本文件适用于畜舍环境及疫区环境气溶胶中口蹄疫病毒、牛病毒性腹泻病毒、牛传染性鼻气管炎病毒检测。

2 规范性引用文件
下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。
GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法
GB 19489 实验室生物安全通用要求
GB/T 27401 实验室质量控制规范
动物检疫术语和定义

3 术语和定义
本文件没有需要界定的术语和定义。

4 缩略语
FMD：口蹄疫
FMDV：口蹄疫病毒
BVDV：牛病毒性腹泻病毒
IBRV：牛传染性鼻气管炎病毒
PCR：聚合酶链式反应
RT-PCR：逆转录聚合酶链式反应
DNA：脱氧核糖核酸
RNA：核糖核酸
cDNA：与信使RNA链呈互补的碱基序列的单链DNA
AGI：全玻璃液体冲击式采样器
PBS：磷酸盐缓冲生理盐水

5 试剂或材料
5.1 除非另有说明，在检测中使用的试剂均为分析纯，水应符合 GB/T 6682 要求。所用液体试剂均需使用无 DNA/RNAase 的容器进行分装。
5.2 体积比 25:24 的酚：氯仿溶液，应 2℃～8℃ 保存。
5.3 体积比 24:1 的氯仿：异戊醇溶液，应 2℃～8℃ 保存。
5.4 0.1% DEPC 水。
5.5 无水乙醇，应 -20℃ 预冷。
5.6 75% 乙醇，配置见 A.5，应 -20℃ 预冷。
5.7 TE 缓冲液，配制见 A.6。
5.8 2 mol/L NaAc 溶液，配制见 A.7。
5.9 阳性、阴性对照。
阳性对照：分别为带有 FMDV 5'-UTR 基因、BVDV 5'-UTR 基因和 IBRV gD 基因的质粒，制备见附录 B。
阴性对照：分别为已知 FMDV、BVDV 阴性气溶胶样本的 cDNA 和 IBRV 阴性气溶胶样本的 DNA。

6 仪器设备
6.1 空气微生物采样箱。
6.2 荧光 PCR 检测仪及配套反应管（板）。
6.3 高速冷冻离心机，最高转速应不低于 13000 r/min。
6.4 冰箱，2℃～8℃ 和 -20℃ 两种。
6.5 微量移液器及配套吸头，量程规格应包含 5 μL、10 μL、100 μL 和 1000 μL。
6.6 1.5 mL 离心管，应无 DNAase 和 RNAase。
6.7 电热恒温水槽（室温至 100℃）。
6.8 涡旋振荡器。
6.9 天平（精密度千分之一以上）。Ⅱ级生物安全柜 A 型。

7 气溶胶样品
7.1 气溶胶样品的采集、灭活处理
应用空气微生物采样箱，使用国际标准的 AGI 采集样本。样品采集后立即用 1% 甲醛溶液灭活处理。采集方法与注意事项应按照附录 C。
7.2 样品购运
样品采集后，放入密闭的自封袋内（一个采样点的样品，放一个自封袋），于保温箱中加冰、密封，24h 内送实验室。
7.3 样品保存
样品在 2℃～8℃ 条件下保存不应超过 24h，若长期保存应置 -70℃ 以下，应避免反复冻融（冻融不超过三次）。

8 实验步骤
8.1 实验室规范
荧光 RT-PCR 检测方法的实验室规范应符合 GB 19489 和 GB/T 27401 要求，整个实验过程中均须使用无 DNAase/RNAase 的一次性耗材，用到的玻璃器皿使用前须 250℃ 干烤 4h 以上，以彻底去除 DNAase/RNAase。
8.2 样品病毒核酸 RNA 和 DNA 提取
所提取物为气溶胶采集液，可能含有病毒。操作者必须带口罩和一次性手套，RNA 提取尽量在人少时进行，防止空气中 RNAase 的污染。所用物品也应无 RNAase。
8.2.1 样品病毒核酸 RNA 提取
8.2.1.1 在 1.5mL 的离心管中加入样品上清液 200μL，再加入 TRIzol 1mL，充分混匀，室温放置 10min。
8.2.1.2 加入 200μL 的氯仿，盖紧离心管盖，用力震荡离心管（溶液充分乳化，成乳白状，无分相现象），室温放置 10min。
8.2.1.3 34℃ 离心、13000r/min、15min，取上层液相移入另一管（切忌吸动白色中间相）。
8.2.1.4 加入等体积异丙醇，轻轻颠倒离心管充分混匀液体，室温放置 10min。
8.2.1.5 离心 4℃、13000r/min、15min，用枪小心吸去所有上清。
8.2.1.6 加 1mL 75% 乙醇洗一遍，离心 4℃、8000r/min、10min，用枪小心吸去所有上清，重复此步骤，在超净台中干燥 5min。
8.2.1.7 加入 50μL TE 缓冲液溶解 RNA，-20℃ 保存备用。
8.2.1.8 可采用经验证的病毒 RNA 提取试剂盒，按照试剂盒使用说明书提取 RNA。
8.2.2 样品病毒核酸 DNA 提取
8.2.2.1 在 1.5mL 的离心管中加入样品上清液 200μL，加入 450μL 裂解缓冲液，再加入 20μL 蛋白酶 K，充分混匀，55℃ 15min。
8.2.2.2 加入 700μL 的酚：氯仿，盖紧离心管盖，用力震荡离心管（溶液充分乳化，成乳白状，无分相现象），室温放置 10min。
8.2.2.3 13000r/min、15min，取上层液相移入另一管（切忌吸动白色中间相）。
8.2.2.4 加入等体积氯仿：异戊醇（24:1），轻轻颠倒离心管充分混匀液体，室温放置 10min。
8.2.2.5 13000r/min、15min，取上清液相移入另一管。
8.2.2.6 加入 1/10 体积 2 mol/L NaAc 和等体积预冷的无水乙醇，轻轻颠倒离心管充分混匀液体，室温放置 10min。
8.2.2.7 13000r/min、5min，用枪小心吸去上清，加 1mL 75% 乙醇洗一遍，8000r/min、10min，用枪小心吸去所有上清，重复此步骤，在超净台中干燥 5min。
8.2.2.8 加入 50μL TE 缓冲液溶解 DNA，-20℃ 保存备用。
8.2.2.9 可采用经验证的病毒核酸提取试剂盒，按照试剂盒使用说明书提取 DNA。
8.3 实时荧光定量 RT-PCR/PCR 扩增
8.3.1 扩增试剂准备
在反应混合物配制区进行。设所需 PCR 管数为 n（n=样本数+1管阴性对照+2管阳性对照），每个测试反应体系需要 20μL 荧光 RT-PCR 反应液。根据所检测的病毒选择引物，见表 D.1。按 D.2 配制反应液，为避免移液器取样损失，建议按 n+1 个反应配制，计算好各试剂的使用量，加入一适当体积小管中，充分混合均匀后，向每个 PCR 管中各分装 20μL，转移至样品处理区。