【国家标准(GB)】 马传染性贫血病间接ELISA技术规程

GB/T17494--1998
马传染性贫血病（简称马传贫，下同)的流行，曾给我国养马业造成巨大的经济损失。经过多年的防制，在全国范围内取得显著成效，已达到控制标准。为消灭马传贫，提供一个先进有效、特异敏感、反应快速、操作方便、易于推广的检测方法，是十分必要的。为此制定马传染性贫血病间接ELISA技术规程。马传贫间接ELISA技术自1983年建立以来，已在全国主要养马省区推广应用十余年之久，在马传贫防制工作中发挥了重要作用。特别是研制的试剂实现了标准化、商品化，并以低耗优质的产品质量，为该方法推广应用奠定了基础，在这方面我们已走在世界前列。本标准的附录A、附录B、附录C都是标准的附录。本标准由中华人民共和国农业部提出。本标准由中华人民共和国农业部畜牧兽医司归口。本标准由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所负责起草。本标准起草人：戴玉坤。
1．范围
中华人民共和国国家标准
马传染性贫而病间接ELISA技术规程Rules of indirect ELISA techniquefor equine infectious anemia diseaseGB/T 17494—1998
本标准规定了马传染性贫血病间接ELISA技术规程的测定原理、仪器设备、试剂、配制溶液、操作步骤、结果判定。
本标准适用于检测马血清中的马传贫疫毒抗体。可用于生产和经营马匹者对未注射马传贫疫苗马匹的检疫，马传贫病马的定性，也可用于对注射马传贫疫苗马匹的免疫状态进行测定。2引用标准
下列标准所包含的条文，通过在本标准中引用而构成为本标准的条文。本标准出版时，所示版本均为有效。所有标准都会被修订，使用本标准的各方应探讨使用下列标准最新版本的可能性。NY127--1987马传贫酶联免疫吸附试验（ELISA间接法）抗原、酶标记抗体制造及检验试行规程
3测定原理
用特制的马传贫病毒抗原（NY127），包被聚苯乙烯微量板孔，使免疫反应在固相载体上进行。当被检血清中有马传贫病毒抗体存在时，则与孔壁上的抗原形成抗原-抗体复合物，再与酶标记的抗体（抗马免疫球蛋白）反应，最后通过测定酶作用底物催化后的产物，进行定性、定量抗体测定。4仪器设备
吸管：1mL、5mL、10mL；
量桶：50mL、100mL、1000mL；
烧杯：50mL、100mL；
玻璃滴管：每滴体积约20～30μL；血清稀释板：20孔板每孔容积为1mL；定量加液器：1mL分装定量；
微量吸液器：50μL、100μL；
分析天平：感量0.001g；
托盘天平：感量0.01g，
水浴锅，
酶标测试仪。
5试剂
除特别注明外，所用试剂皆为分析纯。国家质量技术监督局1998-08-31批准1999-01-01实施
磷酸氢二钠；
磷酸二氢钠；
氯化钠；
柠檬酸；
磷苯二胺（化学纯）;
过氧化氢（浓度30%）；
吐温-20(Tween-20);www.bzxz.net
白明胶(Gelatin white）（E.Merck)；健康牛血清(无污染)；
浓硫酸（纯度95%~98%）；
GB/T 17494—1998
酶标记抗体（冻干品，活性和特异性应符合NY127，见附录A）马传贫病毒抗原包被板（活性和特异性应符合NY127，见附录B)；阴性及阳性对照血清（冻干品,活性和特异应符合NY127)。6配制溶液
6.1磷酸盐缓冲液(0.02mol/LpH7.2PBS)6.1.10.2mol/L磷酸氢二钠溶液：称取磷酸氢二钠（Na2HPO。·12H,0)71.64g，先加适量的去离子水加热溶解，最后定容至1000mL，混匀。6.1.20.2mol/L磷酸二氢钠溶液：称取磷酸二氢钠（NaH,PO·2H2O)31.21g，先加适量的去离子水加热溶解，最后定容至1000mL，混匀。6.1.3量取0.2mol/L磷酸氢二钠溶液360mL，0.2mol/L磷酸二氢钠溶液140mL，称取氯化钠38g，混在一起，用去离子水溶解稀至5000mL。6.2洗液（0.02mol/LpH7.2PBS-0:05%吐温-20）量取0.02mol/LpH7.2PBS1000mL，加入0.5mL吐温-20，混匀。6.3血清及酶标记抗体稀释液（0.02mol/LpH7.2PBS-0.05%吐温-20-0.1%白明胶-10%健康牛血清）
量取洗液（6.2)100mL，加入100mg白明胶加热溶解，冷却后量取90mL，加入健康牛血清10mL，混。
6.4底物溶液（pH5.0磷酸盐-柠檬酸缓冲液，内含0.04%邻苯二胺及0.045%过氧化氢）6.4.1pH5.0磷酸盐-柠檬酸缓冲液：称取柠檬酸（C.H.O，·H.O)21.01g，用去离子水溶解，定容至1000mL。量取243mL与0.2mol/L磷酸氢二钠溶液（6.1.1)257mL混合，于4℃冰箱中保存不超过周。
6.4.2称取40mg邻苯二胺，溶于100mLpH5.0磷酸盐-柠檬酸缓冲液（6.4.1)中（用前从4℃冰箱中取出，在室温下放置20～30min平衡温度），待溶解后，加入150uL过氧化氢混匀。根据试验所需量按此比例增减。现用现配，剩余液废弃。6.5终止剂：2mol/L硫酸
量取浓硫酸4mL加入32mL去离子水中，混匀。7操作步骤
7.1洗板
去掉抗原包被板的密封条及板孔保护膜，向各孔注入洗液，浸泡约3min，甩干，再重新注入洗液，重复洗一次，甩净孔内残液，再在滤纸上拍打吸干。7.2加被检血清及对照血清
GB/T17494—1998
将被检血清登记编号后，用50L微量吸液器依次各取50L加入到血清稀释板的各孔内（每份血清各用1个加样嘴）。用定量加液器，将0.95mL的稀释液（6.3)依次加入装有血清的各孔内，使血清做1：20倍稀释。混匀后用100μL微量吸液器将被检血清依次加入抗原包被板孔内（每份血清各用1个加样嘴），每份血清加两个孔。每块反应板均需设阳性对照及阴性对照血清。冻于的阴、阳性对照血清，按瓶上标注量加入稀释液（6.3），溶解后加入上述包被板孔内。阴、阳性对照血清各两孔，每孔100μL。盖好板盖，置37℃水浴中，保温１h。
7.3洗板
甩掉板孔内的血清，向各孔注入洗液，按（7.1)方法洗三次，甩净孔内残液，再在滤纸上拍打吸干。7.4加酶标记抗体
按瓶签标注量，用稀释液（6.3）将冻干酶标记抗体溶解混匀后，每孔加100uL，盖好板盖，置37℃水浴中，保温1h。
7.5洗板
甩掉板孔内的酶标记抗体，向各孔注入洗液，按（7.1）方法洗三次，甩净孔内残液，再在滤纸上拍打吸于。
7.6加底物溶液
用100μL微量吸液器，每孔加新配制的底物溶液100μL，在室温下避光反应大约5～10min（见附录 C)。
7.7终止反应
用玻璃滴管每孔滴加终止剂1滴。8结果判定
8.1目测法
阳性对照血清孔呈鲜明的桔黄色，阴性对照血清孔无色或基本无色，被检血清孔凡显色者即判为马传贫病毒抗体阳性。如遇颜色反应较弱，但与阴性对照血清孔还有差异者，用目测法难以判定时，则以比色法测定结果为最终结果。
8.2比色法
用酶标测试仪，在波长492nm下，测定各孔OD值，阳性对照血清的两孔平均OD值大于1.0，阴性对照血清的两孔平均OD值小于或等于02为正常反应。按以下两个条件判定结果：被检血清的两孔平均OD值与阴性对照血清的两孔平均OD值之比，大于或等于2,且被检血清的两孔平均OD值在0.2以上者，判为马传贫病毒抗体阳性，否则为阴性。107
GB/T17494—1998
附录A
（标准的附录）
马传贫酶标记抗体质量的说明
马传贫酶标记抗体（冻干品），系山羊抗马IgG与辣根过氧化物酶的结合物。对标准阳性血清的平切终点(PEP)应≤0.25μg/mL，平切滴度(PT)应≥1：10240倍。酶标记抗体用二倍平切终点的浓度，对标准阳性血清与标准阴性血清的1：20倍稀释液进行测定,阳性吸收值应≥1.0,阴性吸收值应≤0.2。在一20℃下可保存2年。附录B
（标准的附录）
马传贫病毒抗原包被板质量的说明马传贫病毒抗原包被板，系马传贫病毒抗原包被40孔或96孔苯乙烯板制备而成，对标准阳性血清的终点滴度≥1：20480倍。在一20℃下可保存2年。附录℃
(标准的附录）
底物溶液作用时间的说明
底物溶液的作用时间与环境温度有关，如温度较高，酶催化作用就快，颜色反应则快。如温度低，酶的催化作用就慢，颤色反应则慢。因此底物的作用时间多依阳性和阴性对照血清颜色变化为准。当阳性对照血清孔呈鲜明的黄色，而阴性对照血清孔无色或基本无色时即要终止反应。标准中规定的底物作用时间5~10min，是在不同温度条件下的大致范围。108
小提示：此标准内容仅展示完整标准里的部分截取内容，若需要完整标准请到上方自行免费下载完整标准文档。