【地方标准】 马铃薯M病毒、马铃薯S病毒检疫鉴定技术规程

DB51/T1203—2011 马铃薯M病毒、马铃薯S病毒检疫鉴定技术规程 前言 本标准由四川省农业厅提出并归口，起草单位为四川省农业厅植物检疫站，主要起草人包括宁红、万佳、刘可、郭迪金、吴志平、黄玲、李凳。本标准涵盖范围、规范性引用文件、术语和定义、原理、试剂与材料、仪器及用具、取样、实验室检验、结果判断及样品保存。 1 范围 本标准规定了马铃薯M病毒和S病毒的取样、实验室检验、结果判定及样品保存的技术要求和方法，适用于感染马铃薯M病毒和S病毒的马铃薯检验和鉴定。 2 规范性引用文件 GB15569-2009 农业植物调运检疫规程，DB51/T868-2009 马铃薯卷叶病毒、Y病毒和A病毒检验鉴定技术规程。 3 术语和定义 3.1 目标条带(target band) 根据某种病毒RNA序列中保守特异的碱基序列设计引物，通过RT-PCR扩增和电泳检测得到的条带，其长度与引物设计一致。目标条带存在与否是判断病毒存在的标准。PVM目标条带为630bp，PVS目标条带为435bp。 4 原理 马铃薯M病毒和S病毒在田间通过蚜虫及农事操作传播，远距离主要通过带毒块茎和种苗的人为流通传播。这两种病毒具有潜隐性，病害症状难以确定病毒种类。采用免疫学和分子生物学方法，可快速检验和鉴定病毒。 5 试剂与材料 除另有说明，使用分析纯试剂及蒸馏水或去离子水。 5.1 免疫学检验试剂 5.1.1 捕捉抗体(Capture antibody) 5.1.1.1 马铃薯M病毒免疫球蛋白，按市售产品稀释，4℃保存。 5.1.1.2 马铃薯S病毒免疫球蛋白，按市售产品稀释，4℃保存。 5.1.2 酶标抗体(Alkaline phosphatase enzyme conjugate) 5.1.2.1 碱性磷酸酶标记的M病毒免疫球蛋白，按产品稀释，4℃保存。 5.1.2.2 碱性磷酸酶标记的S病毒免疫球蛋白，按产品稀释，4℃保存。 5.1.3 包被缓冲液(Coating buffer) 2.93g 碳酸氢钠、1.59g 碳酸钠、0.2g 叠氮化钠，1000mL蒸馏水溶解，pH 9.6，4℃保存。 5.1.4 洗涤液(PBST Buffer) 1.15g 无水磷酸氢二钠、0.2g 氯化钾、0.2g 无水磷酸二氢钾、8.0g 氯化钠、0.5g 吐温-20，1000mL蒸馏水溶解，pH 7.4。 5.1.5 样品提取液(GEB buffer) 1.3g 无水硫酸钠、20.0g 聚乙烯吡咯烷酮、0.2g 叠氮化钠、2.0g 鸡蛋清白蛋白粉、20.0g 吐温-20，1000mL洗涤液溶解，pH 7.4，4℃保存。 5.1.6 酶标抗体稀释缓冲液(ECI Buffer) 0.2g 牛血清白蛋白或脱脂奶粉，2.0g 聚乙烯吡咯烷酮溶于适量溶液中备用。