【卫生标准】 职业接触三硝基甲苯的生物限值

职业接触三硝基甲苯的生物限值

1 范围

1.1 本标准规定了职业接触三硝基甲苯化合物的生物监测指标、生物限值及监测检验方法。

1.2 本标准适用于职业接触三硝基甲苯劳动者的生物监测。

2 生物监测指标和接触限值

生物监测指标和接触限值见表1。

3 监测检验方法

血中4-氨基-2,6二硝基甲苯-血红蛋白加合物的监测检验按附录A执行。

附录 A
（规范性附录）
血中4-氨基-2,6 二硝基甲苯-血红蛋白加合物的竞争抑制性酶联免疫测定法

A.1 原理

4-氨基-2,6 二硝基甲苯 (4A)是 TNT 在体内的主要代谢产物之一，在体内可与血红蛋白共价结合形成 4A-血红蛋白加合物(4A-Hb)。本实验利用抗原-抗体的竞争性抑制反应检测半抗原(4A-Hb)。将 4A-Hb 和一定量的等体积单克隆抗体(McAb)按照顺序加入到已经包被有检测抗原的 (4A-BSA)酶联免疫测定试板上，4A-Hb与包被的 4A-BSA 对抗体产生竞争性结合反应。洗去未结合的抗体后，用酶标二抗与包被抗原的抗体相结合，再显色测定吸光度。吸光度与结合到酶标板上抗体的量成正比例关系，与 4A-Hb 的量呈反比例关系。

A.2 仪器

A.2.1 酶联免疫检测仪，490 nm 波长。
A.2.2 离心机。

A.3 试剂

A.3.1 包被缓冲液：0.05 mol/L 碳酸盐缓冲液(pH 9.6)。
A.3.2 底物缓冲液：柠檬酸-磷酸盐缓冲液(pH 5.0)。
A.3.3 底物反应液：将邻苯二胺(OPD)5 mg溶解在10 mL底物缓冲液中，临用前加入15 μL体积分数为30%的双氧水(H₂O₂)。
A.3.4 4A标准液。
A.3.5 辣根过氧化物酶标记羊抗鼠抗体 HRP-IgG。
A.3.6 4A-Hb单克隆抗体。
A.3.7 稀释液：含5%小牛血清的0.01 mol/L PBS缓冲液。
A.3.8 4A-BSA溶液。
A.3.9 酶标板洗涤液：含0.1%吐温-20的0.01 mol/L PBS(pH 7.4)。

A.4 样品采集、运输和保存

采集静脉血 1.0 mL，注入经肝素处理的试管中，混匀。

A.5 分析步骤

A.5.1 样品处理

将样品离心(800 g, 5 min)，将血浆吸出，向红细胞中加 3 mL 生理盐水于红细胞中混匀，离心 (800 g, 5 min)弃去上清液，反复洗涤 3 次。冰冻过夜，融化后剧烈振荡 5 min，使红细胞破裂释放出血红蛋白，1 000 g离心 5 min，所得上清液即为待测样品。

A.5.2 样品测定与标准曲线的绘制

a) 将 BSA 用包被缓冲液稀释成 2 μg/mL后，在酶标板上每孔加入 100 μL, 4℃过夜。
b) 每孔先加入 50 μL待测样品，再加入等体积的 1:10 000 的 4A-Hb单克隆抗体，37℃保温 1.5 h后，用酶标板洗涤液冲洗 4 次，在纸上拍干水滴。
c) 每孔加入 RP-SAMG 100 μL, 37℃保温 1 h，冲洗 4 次，拍干后加入底物反应液 100 μL, 37℃保

湿 15 min。

4. 每孔加入 50 μL 2 mol/L 的硫酸(H₂SO₄)中止反应，用 ELISA 仪测定 490 nm 吸光度值。
5. 每块酶标板需要分别制作标准曲线，除了以不同浓度 4A 标准液代替样品外，其他所有操作步骤与样品一致。
6. 计算以标准液浓度及其对应的吸光度百分值绘制标准曲线，根据每块酶标板的标准曲线计算出样品浓度。4A-Hb 加合物浓度以每克血红蛋白中含 4A 量表示。

A.6 说明

A.6.1 本方法的最低检出浓度为 100 ng/g Hb，测定范围为 100 ng/g～2 000 ng/g Hb。

A.6.2 回收率：加标量为 5, 25, 50, 100, 250, 500 ng/mL 时，回收率分别为 101%, 102%, 103%, 82%, 99%, 91%。

A.6.3 样品保存时间：4℃冰箱保存 10 d，浓度下降 2.6%。