【国家标准】 蜂蜜中脯氨酸的测定 高效液相色谱法

ICS 67.180.10 X31 GB 中华人民共和国国家标准 GB/T 32946—2016 蜂蜜中脯氨酸的测定 高效液相色谱法 Determination of proline in honey - High performance liquid chromatography 2016-08-29 发布 2017-03-01 实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 中国国家标准化管理委员会 发布 前言 本标准按照 GB/T 1.1-2009 给出的规则起草。 本标准由中华全国供销合作总社提出。 本标准由全国蜂产品标准化工作组归口。 本标准起草单位：中国农业科学院蜜蜂研究所、农业部蜂产品质量监督检验测试中心（北京）、中国养蜂学会。 本标准主要起草人：李熠、张金振、黄京平、吴杰、吴黎明、赵静、薛晓锋、周金慧、陈芳、王鹏、陈兰珍。 1 范围 本标准规定了蜂蜜中脯氨酸含量的高效液相色谱测定方法。 本标准适用于蜂蜜中脯氨酸含量的测定。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。 凡是注日期的引用文件，仅注日期版本适用；不注日期的引用文件，其最新版本（包括修改单）适用。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法。 3 方法提要 试样中的脯氨酸用硼酸缓冲液提取后，经柱前衍生处理，采用液相色谱荧光检测器检测，外标法定量。 4 试剂和材料 除非另有说明，均使用分析纯试剂，水符合 GB/T 6682 一级水要求。 试剂包括：甲醇、乙腈、四氢呋喃、乙酸钠、乙酸、硼酸、乙二胺四乙酸二钠、氢氧化钠、磷酸、盐酸等。 L-脯氨酸标准品（CAS 147-85-3），纯度≥99%。 NBD-F（4-氟-7-硝基-2,1,3-苯并氧杂二唑，CAS 29270-56-2），纯度≥99%。 主要溶液配制： - 0.1 mol/L 氢氧化钠溶液 - 0.1 mol/L 乙酸钠缓冲液（pH 7.2） - 0.1 mol/L 硼酸缓冲液（pH 8.0） - 0.1 mol/L 盐酸溶液 - NBD-F 衍生化溶液（100 mmol/L） - 脯氨酸标准储备液（1000 mg/L，4℃保存） 5 仪器和设备 高效液相色谱仪（配荧光检测器）、分析天平（0.01 g、0.001 g、0.00001 g）、涡旋混匀器、pH计（±0.02）、恒温水浴锅、超声波清洗器等。 6 试样的制备与保存 将样品充分搅拌均匀，取约0.5 kg置于样品瓶中密封标记，于4℃保存。 7 分析步骤 7.1 提取 称取试样1 g（精确至0.001 g），加入20.0 mL硼酸缓冲液溶解，超声提取10 min，转移至50 mL容量瓶定容，0.22 μm滤膜过滤备用。 7.2 衍生化 取200 μL样品溶液，加入乙腈与NBD-F溶液，涡旋混匀后于60℃避光反应10 min，冰水冷却后加入盐酸终止反应。 7.3 液相色谱条件 色谱柱：C18（150 mm×4.6 mm，5 μm）或等效柱； 流动相A：乙酸钠缓冲液-甲醇-四氢呋喃（900:95:5）； 流动相B：甲醇； 柱温：30℃；进样量：20 μL； 检测器：荧光检测（激发470 nm，发射530 nm）。 梯度洗脱程序： 0.00 min A100% B0% 0.50 min A75% B25% 7.00 min A75% B25% 8.00 min A0% B100% 10.00 min A0% B100% 12.00 min A100% B0% 15.00 min A100% B0%