【其他行业标准】 胶鞋抗菌性能试验方法

ICS61.060
备案号：45282—2014
中华人民共和国化工行业标准
HG/T 3663—2014
代替HG/T36632000
胶鞋抗菌性能试验方法
Testing method for antibacterial activity of rubber shoes2014-05-12发布
2014-10-01实施
中华人民共和国工业和信息化部发布言
本标准按照GB/T1.1--2009给出的规则起草。HG/T3663—2014
本标准代替HG/T36632000《胶鞋抗菌性能的试验方法（琼脂平板法）》，本标准与HG/2000相比主要技术变化如下：
T3663·-1
删除了规范性引用文件的相关内容（见2000年版的2）；修改了原理（见3，2000年版的3）；修改了试验所用的仪器、设备（见4，2000年版的6）；修改了培养基和营养肉汤制法中的高压火菌的温度和时间的规定（见5.1.2、5.2.2，2000年版的7.1.2、7.4.2)；
增加了试验细菌的注1、注2、注3（见6）；增加了冻十菌的活化的内容（见7.1）；增加了对照样的内容（见8.2）；修改了试验步骤的内容（见9，2000年版的10）；增加了试样抗菌效果的表示（见10.4）；增加了评价（见11）；
修改了试验报告的内容（见12，2000年版的12）。本标准出中国有油和化学工业联合会提出。本标准山全国橡胶橡胶制品标准化技术委员会胶鞋分技术委员会（SAC/TC35/SC9)少III。本标准起草单位：1海市质量监格检验技术研究院、东莞市恒宁仪器有限公司、1海回力鞋业有限公司、宝达鞋业有限公司、福建省鞋类产品质量监督检验中心。本标准主要起草人：胡雪莲、徐德佳、刘龙、马庆华、丁家庆、尤永谊、段文锋、李岑变、侍春鸣、何晓玲。
本标准所替代标准的历次版本发布情况为：HG/T36632000。
胶鞋抗菌性能试验方法
HG/T3663—2014
警告：使用本标准的试验操作人员应具有微生物知识和实验室工作的实践经验并经过生物安全培训。本标准需要使用细菌，并且具有促进细菌繁殖的条件，所以应在规定的试验环境下进行试验。本标准并未指出所有可能的安全问题，使用者有责任采取适当的安全和健康措施，并遵守国家有关法规的规定。
注意：在执行本标准程序时可能使用或产生一些物质，包括产生一些废弃物。在操作中应执行适当的安全作业文件或使用后物质的销毁文件并保证满足地方环保要求。1范围
本标准规定了采用琼脂平板法测定施行抗菌防臭加工的胶鞋及其部件的抗菌性能试验方法。本标准适用于胶鞋及其部件抗菌性能的测定本标准不适用于抗菌剂在试验琼脂上完全不扩散的试样，也不适用于抗菌剂与琼脂起反应的试样。2术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。2.1
抗菌防臭加工
antibacterial and anti-stinking processing指胶鞋及其部件经过添加抗菌材料（物质），以抑制胶鞋在穿着过程中鞋腔内和足部的细菌繁殖生长为目的的加工。
抑菌圈antibacterial clearzonc抗菌材料（物质)阻碍细菌繁殖生长，从而在琼脂培养基表面与试样接触部分及其周围形成的透明区域。
抗菌性antibacterial activity抑制细菌生长繁殖，或将细菌杀火的特性。2.4
抑菌圈宽度widthof antibacterial clearzone抗菌材料（物质)阻碍细菌繁殖生长，从而在培养Ⅲ里琼脂表面与试样接触的边界形成无细菌繁殖区域，即试样边缘形成的透明区域的宽度。3原理
平Ⅲ内注人两层营养琼脂培养基，下层为无菌培养基，1层为有菌培养基。试样放在两层培养基，培养一定时间后，利用胶鞋及其部件中抗菌材料（物质)在营养琼脂培养基内的扩散作用，即当其扩散过程中保持了足够浓度时，可以对某些细菌的生长起到抑制作用，从而产生一个透明的抑菌圈。根据培养基与试样接触区域的菌落生长情况及抑菌圈的情况定性评定胶鞋产品的抗菌性能的效果。4仪器、设备
4.1比浊仪（用于测定试验菌液浓度，可用分光光度计等其他设备替代）。4.2二级生物安全柜。
HG/T3663—2014
4.3水浴锅：温度能保持在46℃士1℃。4.4恒温培养箱：温度能保持在36℃士1℃。4.5压力蒸汽火菌锅：温度能保持在121℃，压力保持在103kPa。4.6
冰箱：温度能保持在2℃～5℃。4.7
接种环：尖端环圈直径约4mm。
移液管：1ml（具0.01ml.刻度）或微量移液器及吸头。4.8
平Ⅲ：直径90mm。
玻璃试管：直径10mm×100mm。
试管、烧瓶等实验室常用器具。游标卡尺：分度为0.02mm。
制取试样的圆形裁刀，裁刀内径：16.0mm士0.2mm。天平：感量0.1g。
培养基和试剂
营养琼脂培养基（半固体培养基）5.1.1成分
蛋白豚
牛肉膏
氯化钠
蒸馏水
pH（25℃）
5.1.2制法
20g（若制备半固体培养基，则为5g）1000ml
除琼脂以外将以I:其他各成分溶解丁蒸馏水中，川4.0mo1/1氢氧化钠溶液校正pH值，然后加人琼脂，加热煮沸，使琼脂溶化，分装烧瓶，于121℃高压火菌15min。5.1.3营养琼脂平板
将5.1.2的营养琼脂培养基取出约15ml，倾注于无菌平Ⅲ中，待营养琼脂冷却凝固后翻转平Ⅲ，置36℃士1℃恒温培养18h～24h。灭菌后的营养琼脂若不马上使用，要放在2℃～5℃温度下保存，保存时间不宜超过10天。使用前要打开平ⅢL，倒置于36℃士1℃恒温培养箱内烘15min～30min。5.1.4营养琼脂斜面
将5.1.2的营养琼脂约5mL加人无菌试管中，然后将试管倾斜放置，使营养琼脂冷却凝固。制备好的斜面培养基如不马上使用要放在2℃～5℃温度下保存，保存时间不超过2周。5.1.5营养琼脂半固体
将5.1.2的营养琼脂半固体约5mL加人无菌试管中，制备好的营养琼脂半固体培养基如不马上使用要放在2℃～5℃温度下保存，保存时间不超过2周。5.2营养肉汤
5.2.1成分
蛋白陈
牛肉膏
氮化钠
蒸馏水
1000ml
pH(25℃）7.2±0.1
5.2.2制法
HG/T3663—2014
按1述成分混匀，溶解后用4.0mol/L氢氧化钠溶液校正：pH值，于121℃高压火菌15min。火菌后的营养肉汤如不马1使用要放在2℃～5℃温度下保存，保存时间不超过2周。5.3无菌生理盐水
5.3.1成分
氯化钠
蒸馏水
5.3.2制法
1000ml
称取8.5g氯化钠溶于1000ml，蒸馏水中，于121℃高压火菌15min。6试验细菌
使用下列革兰氏阴性菌及革兰氏阳1性菌：金黄色葡猫球菌Staph.ylococcusaureus（ATCc6538）革兰氏阳性；大肠杆菌Escherichiacoli（8099或ATCC25922）革兰氏阴性；枯草芽孢杆菌黑色变种Bacillussubtilusvar.niger（ATCC9362）第兰氏阳性。
注1：可使用加人世界菌种保藏联合会（WFCC)的菌种保藏机构提供的\上述菌种等效的试验细菌。注2：出于待测试样所用的抗菌剂抗菌效果的差异，测试所用菌种的范围可能会扩大，根据需要可采用其他的试验菌种，培养基成分、培养温度和培养条件可根据需要进行调整。注3：本标准中方法针对细菌繁殖体.如需检测试样对细菌芽孢的抑制作用，可参照《消毒技术规范》中相关方法对芽孢进行培养。
7试验菌液的制备及细菌的保存
7.1冻干菌的活化
7.1.1将冻1菌分别融化分散在2ml.的营养肉汤中成浮状，置36℃士1℃恒温培养18h～24h，形成菌恐液。
7.1.2川接种环取7.1.1的菌悬液，以划线法接种到营养琼脂平板1:，置36℃士1℃恒温培养18h～24h。
7.1.3从7.1.2的接种后的营养琼脂平板.1取典型菌落接种在营养琼脂斜面试管内，置36℃士1℃恒温培养18h～24h。
7.2细菌的保存
7.2.1琼脂斜面保存
将菌种接种于营养琼脂斜面上，置36℃士1℃恒温培养18h～24h，放在4℃士1℃冰箱中保存。保存期不超过1个月，每月传代1次，传代次数不超过10代。7.2.2半固体穿刺保存
将细菌穿刺接种于营养琼脂半固体试管内，置36℃士1℃恒温培养18h～24h。将其取出，加适量无菌液体石蜡覆盖在培养基1以隔绝空气，置于4℃士1℃冰箱内保存3个月～6个月。如需长期保存，则每3个月～6个月传代1次。7.2.3分离培养
工作用菌种每隔3个月～6个月在营养琼脂平板.1分离单个菌落1次，选典型的菌落接种于营养琼脂斜面上，可以代替原有的工作用菌种。8试样
8.1取样
从施放抗菌防臭剂的部件1取样，用朝向于足部的一而进行测试，用直径16.0mm士0.2mm的圆3
HG/T3663—2014
形裁刀裁取试样，若鞋内腔山多种施放抗菌防臭剂的材料组成，那么各种材料各取1个样品（若鞋内腔有的材料因太小不能取样，即连同旁的材料一起裁取试样）。若鞋内帮是山一种材料组成，取样从鞋的前后帮各取1个样品。若鞋内底是山一种材料组成，取样从鞋的前掌部位及后跟部位各取1个样品。8.2对照样
取1块与试样材质相同但未经抗菌处理的材料作为对照，尺寸与试样相同。如果没有，则取不经任何处理的100%棉织物。
9试验步骤
9.1试验前准备
9.1.1试管、三角烧瓶、吸头、移液管及平Ⅲ预先川蒸馏水洗净烘下。将试管、三角烧瓶、移液管塞上棉塞，同时吸头、移液管要用纸包严，并将1：述所有器Ⅲ在121℃高压火菌30min后烘十备用。9.1.2用游标卡尺测量待测试样的实际直径，并记录。9.2试验菌液的制备
9.2.1从7.2.1保存的菌中分别移植一个接种环接种于营养琼脂斜面1，置36℃±1℃恒温培养18h~24h。
从9.2.1的营养琼脂斜而培养菌分别移植一个接种环接种于2mL营养肉汤管中，并在36℃士1℃恒温培养18h～24h。
9.2.2用无菌生理盐水20倍稀释营养肉汤，采用适当的方法测定菌液浓度，将稀释后菌浓度为1×108CFU/ml～5×10*CFU/ml.的菌液作为试验菌液。该试验菌液在4℃±1℃冰箱内保存，在4h内使用。
9.3试验
9.3.1制备下层无菌培养基
向无菌平中倾注10ml.营养琼脂培养基，并使其凝固。9.3.2制备上层有菌培养基
取46℃士1℃的营养琼脂培养基150ml放人烧瓶，加人1mlL试验菌液。振荡烧瓶使细菌分布均匀，向9.3.1中的每个平Ⅲ中倾注5ml.，并使其凝固。接种过的琼脂培养Ⅲ应在1h内使用。9.3.3用无菌锻子将试样和对照样分别放于平Ⅲ中央，均匀地按压在琼脂培养基上，直到试样或对照样和琼脂培养基之间很好地接触。9.3.4将试样放在琼脂培养基.1:后，立.即放入36℃士1℃恒温培养18h～24h，要确保在整个培养期中试样与琼脂培养基保持接触。10试验结果
10.1从平Ⅲ的底部观察并用游标卡尺测量试样抑菌圈的直径。10.2试验结果的计算
抑菌圈宽度按公式(1)计算：
式中：
W----抑菌圈宽度的数值，单位为毫米（mm）；D--抑菌圈最短直径的数值，单位为毫米(mm)；d-----试样的直径的数值，单位为毫米（mm）。10.3试验结果的表示
HG/T3663-—2014
每个样品和试验数量不得少于2个，以算术平均值表示试验结果（取值保留小数点后1位）。10.4试样的抗菌效果表示
测量抑菌圈宽度后，用镊子将试样从营养琼脂培养基上移去，在光源下观察培养基与试样（或对照样)接触区域的菌落生长情况。菌落生长情况用无生长、微弱生长、（与对照样相比）生长变弱、（与对照样相比)无明显差异表示。
试样的抗菌效果按表1表述。
表1抗菌材料的抗菌效果评估
抑菌圈宽度/mm
菌落生长情况：
无菌落生长
无菌落生长
无菌落生长
菌落微弱生长
菌落生长变驶
菌落生长无明显差异
抑菌圈宽度超过1mm，无菌落生长h抑菌圈宽度不足1mm，无菌落生长b无抑菌圈，试样接触区域无菌落生长。无抑菌圈，试样接触区域只有极少数菌落生长，菌落生长受到明显抑制d
无抑菌圈，与对照样和比试样接触区域菌落约减少了·半。
无抑菌圈，与对照样相比试样接触区域菌落生长无明显变化或仪略有减少菌落生长情况：上层培养基中菌落生长情况。效果评估
抗菌效果良好
有·定抗菌效果
无明显抗菌效果
试样与琼脂接触区域无菌落生长且抑菌圈宽度超过1mm：此时，在试样周围可见··圈尤菌落生长的透明环。较人的抑菌圈宽度说明试样中含有大量的抑菌活性物质，但也可能显示该试样中所含的抑菌剂与试样表面结合能力较弱。
试样与琼脂接触区域尤菌落生长Ⅱ抑菌圈宽度为0：此时.试样周围无透明环。该种情况可能是山试样中所含的活性抗菌物质扩散率低导致的。即便没有抑菌圈，只要试样与琼脂接触面无菌落生长，同样显示试样抗菌效果良好，
菌落微弱生长：无抑菌圈，试样接触区域只有岑量极少数菌落生长，菌落生长受到明显抑制。该种情况表明试样有·-定抗菌效果。
：菌落生长变弱：无抑菌圈，与对照样相比试样接触区域菌落数量约减少了一半或菌落直径变小。该种情况说明试样无明显抗菌效果。
11评价
当样品所有试样均满足表1中“抗菌效果良好”的要求时，认为该样品具有抗菌效果；当样品对于某种菌的抗菌性能测试满足表1中“抗菌效果良好”的要求时，认为该样品对该种菌具有抗菌效果；
当样品对某种菌的抗菌性能测试满足表1中“有一定抗菌效果”的要求时，认为该样品对该种菌有一定抗菌效果；
当样品对某种菌的抗菌性能测试满足表1中“无明显抗菌效果”的要求时，认为该样品对该种菌无明显抗菌效果。
12试验报告
试验报告应包括下列内容：
a）本标准号；
b）试样的名称、规格和编号；
HG/T3663—2014
菌种名称及接种浓度；
试验结果（抑菌圈大小、生长情况描述、抗菌效果评估结论）；试验H期；
试验者、复核者。
［1]IS20645：2004《纺织物
参考文献
抗菌活性的测定
mination of antibacterial activityHG/T3663—2014
琼脂平Ⅲ持散试验》（TextilefabricsAgar diffusionplate test)
Deter-
中华人民共和国
化工行业标准
胶鞋抗菌性能试验方法
HG/T3663-2014
出版发行：化学工业出版社
（北京市东城区青年湖南街13号邮政编码100011）北京科印技术咨询服务公司海淀数码印刷分部9
880mm×1230mm1/16印张X
字数17.6千
2014年9月北京第1版第1次印刷
书号：155025·1754
购书咨询：010-64518888
售后服务：010-64518899
网址：http：//www.cip.com.cn凡购买本书，如有缺损质量问题，本社销售中心负责调换。定价：12.00元Www.bzxZ.net
版权所有
违者必究
小提示：此标准内容仅展示完整标准里的部分截取内容，若需要完整标准请到上方自行免费下载完整标准文档。