【国家标准】 食品安全国家标准 食品中低聚半乳糖的测定

中华人民共和国国家标准
GB5009.2892023
食品安全国家标准
食品中低聚半乳糖的测定
2023-09-06发布
2024-03-06实施
中华人民共和国国家卫生健康委员会发布
国家市场监督管理总局
1范围
食品安全国家标准
食品中低聚半乳糖的测定
本标准规定了食品中低聚半乳糖的液相色谱测定的方法。GB5009.2892023
本标准适用于婴幼儿配方食品（不包括特殊医学用途婴儿配方食品）、婴幼儿辅助食品、乳制品、饮料、焙烤食品中低聚半乳糖的测定。本标准不适用于含有其他低聚还原性物质会造成干扰的食品中低聚半乳糖的测定2原理
试样中的低聚半乳糖（n为27)经水溶液提取、2-氨基苯甲酰胺衍生，用淀粉葡糖替酶酶解去除麦芽糊精、淀粉干扰后，用高效液相色谱-荧光检测器检测。采集的色谱峰根据用相同试验条件下液相色谱串联质谱法确定的相同聚合度的低聚半乳糖的保留时间定性，采用相对应聚合度和相对分子质量的麦芽糖类聚糖标准物质外标法定量，扣除乳糖、麦芽糖含量后，得出低聚半乳糖含量3试剂和材料
除非另有说明，本方法所用试剂均为分析纯，水为GB/T6682规定的一级水。警示一一氰基硼氢化钠和2-甲基吡啶-N-甲硼烷为危险物品，遇水释放易燃气体、对环境有危险谨遵试剂使用说明规范。请穿戴个人防护装备，在通风柜下进行所有操作。3.1试剂
3.1.1二甲基亚矾[(CH)2SO]：色谱纯。3.1.22-氨基苯甲酰胺(CHaN2O)。3.1.3氰基硼氢化钠(NaBH3CN)。3.1.42-甲基吡啶-N-甲硼烷(C。HN·BH3)。3.1.5乙酸(CHCOOH)。
6乙酸铵（CHCOONH4）
3.1.7甲酸铵(HCOONH4）。
3.1.8甲酸(HCOOH)。
3.1.9乙睛(CHsCN)：色谱纯。
3.1.10淀粉葡糖苷酶（CAS号：9032-08-0)：酶活力单位≥60U/mg注：酶活力测定方法参考GB1886.1742016中A.3。3.2试剂配制
3.2.1乙酸-二甲基亚砜溶液（3+7，体积比）：分别量取3mL乙酸和7mL二甲基亚砜在烧杯中混合均匀，备用。
GB5009.2892023
2-氨基苯甲酰胺衍生溶液（0.35mol/L)：准确称取476mg2-氨基苯甲酰胺和630mg氰基硼氢3.2.22
化钠或1070mg2-甲基吡啶-N-甲硼烷于烧杯中，用10mL乙酸-二甲基亚砜溶液（3+7）溶解，混合均匀。
3.2.3乙酸铵溶液（0.2mol/L,pH4.5±0.1）：称取1.54g乙酸铵，用80mL水溶解后，用乙酸调节pH至4.5±0.1，用水稀释至100mL。临用现配。3.2.4淀粉葡糖苷酶溶液（约180U/mL）：称取相当于活力约900U淀粉葡糖苷酶溶于5mL乙酸铵溶液（0.2mol/LpH4.5±0.1)中，搅拌至完全溶解。临用现配。3.2.5甲酸铵溶液（50mmol/L，pH4.4±0.1)：称取3.15g甲酸铵，用900mL水溶解后，用甲酸调节pH至4.4±0.1,用水稀释至1000mL。临用现配。3.3标准品
3.3.1麦芽糖标准品(Ci2H22On,CAS证书的标准物质。
号：69-79-4)纯度≥98%，或经国家认证并授予标准物质3.3.2麦芽三糖标准品(C1H32O，6,CAS准物质证书的标准物质。
3.3.3麦芽四糖标准品(C24H42OZ1CAS准物质证书的标准物质。
3.3.4麦芽五糖标准品(C3。Hs2O26,CAS准物质证书的标准物质。
3.3.5麦芽六糖标准品(CeH2O31,CAS物质证书的标准物质。
3.3.6麦芽七糖标准品(C42H，2O36,CAS准物质证书的标准物质。
3.3.7乳糖标准品(C，2H22O.CAS书的标准物质。
3.4标准溶液配制
号：1109-28-0)纯度≥98%，或经国家认证并授予标号：34612-38-9）纯度≥95%，或经国家认证并授予标号：34620-76-3）纯度≥95%，或经国家认证并授予标号：34620-77-4)纯度≥95%，或经国家认证并授予标准号：34620-78-5）纯度≥95%，或经国家认证并授予标号：63-42-3)纯度≥98%，或经国家认证并授予标准物质证3.4.1标准储备液（10.00mg/mL)：分别准确称取100mg（精确至0.1mg）的乳糖、麦芽糖、麦芽三糖、麦芽四糖、麦芽五糖、麦芽六糖、麦芽七糖标准品，用水溶解并定容至10mL、混匀。将各标准储备液转移至储液瓶中，手4℃保存，保存期1个月3.4.2混合标准中间液（1.000mg/mL)：吸取各标准储备液（10.00mg/mL)1.00DmL于10mL容量瓶
中，加水定容至刻度，混匀。临用现配。3.4.3混合标准使用液（100.0μg/mL)：吸取混合标准中间液（1.000mg/mL)1.00mL于10mL容量瓶中，加水定容至刻度，混匀。临用现配。3.4.4混合标准系列工作液：分别吸取混合标准中间液（1.000mg/mL)1.00mL、2.50mL、5.00mL于10mL容量瓶中，加水定容至刻度，混匀。分别吸取混合标准使用液（100.0μg/mL)0.10mL、1.00mL、5.00mL于10mL容量瓶中，加水定容至刻度，混匀。混合标准系列工作液的质量浓度分别为1.000μg/mL、10.00μg/mL、50.00μg/mL、100.0μg/mL、250.0μg/mL4仪器和设备
4.1高效液相色谱仪：配备荧光检测器。4.2天平：感量为0.1mg和1mg。
和500.0ug/mL。临用现配。
4.3pH计：精度为0.01。
4.4涡旋混合器。
4.5恒温水浴锅。
4.6粉碎机。
4.7离心机。
4.8有机微孔滤膜：0.22μm。
5分析步骤
5.1样品前处理
5.1.1试样制备
GB5009.289—2023
取有代表性的样品至少200g，液态样品摇匀：基质均匀的半固态和粉状样品混匀：其他样品需匀浆或粉碎均匀。如特殊需要，制备好的试样冷藏保存，备用。5.1.2其他低聚还原性物质鉴别
试样按附录A方法进行其他低聚还原性物质鉴别，如无其他低聚还原性物质干扰，则本方法适用，可按5.1.3进行处理。
5.1.3试样处理
称取1.000g试样于50mL烧杯中用水溶解，转移至50mL容量瓶中，加水定容至刻度，混匀，作为试样液，待用。吸取20μL试样液于2m具旋盖离心管中，加入200uL2-氨基苯甲酰胺衍生溶液，涡旋混合30s，在60℃水浴中保温120min，取出放至室温，加入1mL乙酸铵溶液（0.2mol/L，pH4.5±0.1)涡旋混合30s。再移取0.50mL混合溶液于2mL离心管中，加入200μL淀粉葡糖苷酶溶液（约180U/mL），在50℃水浴中保温30min，取出放至室温，加入0.70mL乙，混匀后6000r/min离心5min，上清液用0.22um有机微孔滤膜过滤后，供高效液相色谱测定。5.1.4空白试验
称取与试样相同质量的水于50mL容量瓶中，以下步骤按5.1.3与试样同时处理。5.1.5标准系列工作液衍生
移取20L标准系列工作溶液于2mL具旋盖离心管中，加入200L2-氨基苯甲酰胺衍生溶液，涡旋混合30s，在60℃水浴中保温120min，取出放至室温，加入1mL乙酸铵溶液（0.2mol/L，pH4.5±0.1）涡旋混合30s。再移取0.50mL混合溶液于2mL离心管中，加入200μL乙酸铵溶液（0.2mo1/LpH4.5±0.1)，在50℃水浴中保温30min，取出放至室温，加入0.70mL乙睛，混匀后6000r/min离心5min，上清液用0.22μm有机微孔滤膜过滤后，供高效液相色谱测定。5.2仪器参考条件
5.2.1色谱柱：酰胺基键合的表面多孔型硅胶色谱柱[150mmx4.6mm（内径)，粒径2.7um]，或等效柱。
5.2.2流动相：流动相A为甲酸铵溶液（50mmol/L,pH4.4±0.1);流动相B为乙睛。
5.2.3流动相流速：1.0mL/min，流动相梯度洗脱程序参见附录B中B.1。5.2.4检测器：荧光检测器，激发波长355nm，发射波长430nm。3
GB5009.2892023
5.2.5柱温：30℃。
5.2.6进样体积：20μL。
5.3标准曲线的制作
将混合标准系列工作液衍生液分别注入高效液相色谱仪中，测定不同聚合度麦芽糖类标准品和乳糖衍生物色谱图峰面积，以混合标准系列工作液中的麦芽糖类标准品和乳糖标准品浓度为横坐标，以不同聚合度麦芽糖类标准品衍生物的峰面积为纵坐标，绘制不同聚合度麦芽糖类标准品和乳糖衍生物标准曲线。不同聚合度麦芽糖类标准品和乳糖衍生物溶液的色谱图参见附录C中图C.1。5.4试样溶液的测定
将试样溶液注入高效液相色谱仪中，参考附录D确定不同聚合度糖的保留时间段，分别记录各聚合度糖衍生物的峰面积之和以及乳糖、麦芽糖衍生物峰面积，根据对应聚合度标准品衍生物的标准曲线分别计算试样溶液中不同聚合度糖的浓度，根据乳糖和麦芽糖标准品衍生物的标准曲线分别计算试样溶液中乳糖和麦芽糖的浓度。试样衍生后色谱图参见附录C中图C.2。6分析结果的表述
试样中低聚半乳糖含量X按公式(1)计算。x=（Zpm-po-pp表亲格）xV×1000mX1000X1000
式中：
X一一试样中低聚半乳糖含量，单位为克每千克（g/kg)：(1)
Ppri一由标准曲线得到的不同聚合度糖衍生物的浓度，单位为微克每毫升（μg/mL)(i=2~7);po
空白试样溶液中衍生物的浓度，单位为微克每毫升（ug/mL)：P乳糖一一试样溶液中乳糖衍生物的浓度，单位为微克每毫升（ug/mL）；P麦芽糖一一试样溶液中麦芽糖衍生物的浓度，单位为微克每毫升（μg/mL）：V
一一试样定容的体积，单位为毫升(mL)：1000——换算系数；
试样的质量，单位为克（g)。
计算结果以重复性条件下获得的2次独立测定结果的算术平均值表示，保留3位有效数字。7精密度
在重复性条件下，获得的2次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的15%。8其他
当称样量为1.000g时，检出限为1.0g/kg，定量限为3.0g/kg。4
A.1原理
附录A
其他低聚还原性物质鉴别方法
GB5009.2892023
试样溶液采用淀粉葡糖苷酶除麦芽糊精、淀粉干扰后，β-半乳糖苷酶水解样品中的乳糖和低聚半乳糖后，经2-氨基苯甲酰胺衍生，用高效液相色谱-荧光检测器检测。将采集信号根据糖聚合度保留时间分段后分别峰加和，采用相对应聚合度麦芽糖类聚糖标准物质外标法分别定量后计算总的衍生物含量，扣除空白溶液和麦芽糖衍生物含量后计算其他低聚还原性物质总含量。若试样中其他低聚还原性物质总含量大于定量限，则标准方法不适用于该试样中低聚半乳糖的测定。A.2试剂
β-半乳糖苷酶溶液：酶活力≥4000U/mL。A.2.1
注：酶活力测定方法参考GB/T334092016。对于不同批次的β-半乳糖苷酶溶液在使用前需进行质量验证。A.2.2乙溶液（75%，体积分数）：量取75mL乙睛加水稀释至100mL。其他同第3章。
A.3仪器和设备
同第4章。
A.4分析步骤
β-半乳糖苷酶溶液验证
A.4.1.1βB-半乳糖苷酶溶液处理吸取700μL水于2mL离心管中，加入50μLβ-半乳糖苷酶溶液（4000U/mL），涡旋混合30s，在60℃水浴中保温120min，随后水浴温度升至100℃保温5min，取出置于4℃冷却10min。吸取20uL混合溶液于2mL具旋盖离心管中，加入200μL2-氨基苯甲酰胺衍生溶液，涡旋混合30s，在60℃水浴中保温120min，取出放至室温，加入1mL乙睛溶液（75%），混匀后6000r/min离心5min上清液用0.22um有机微孔滤膜过滤后，供高效液相色谱测定A.4.1.2标准系列工作液处理
移取500μL标准系列工作溶液，加入250uL水，涡旋混合30s，在60℃水浴中保温120min，随后水浴温度升至100℃保温5min，取出置于4℃冷却10min。吸取20uL混合溶液于2mL具旋盖离心管中，加入200μL2-氨基苯甲酰胺衍生溶液，涡旋混合30s，在60℃水浴中保温120min，取出放至室温，加入1mL乙睛溶液（75%），混匀后6000r/min离心5min，上清液用0.22μm有机微孔滤膜过滤后，供高效液相色谱测定。
3验证规则
按照A.4.3、A.4.4、A.4.5对处理后的β-半乳糖苷酶衍生液进行测定，计算溶液中其他低聚还原性物质含量，若含量小于检出限1.0g/kg，则酶溶液验证合格，可进行试样前处理步骤。5
GB5009.2892023
A.4.2样品前处理
A.4.2.1试样处理wwW.bzxz.Net
称取1.000g试样于50mL烧杯中用水溶解，转移至50mL容量瓶中，加水定容至刻度，混匀，作为试样液，待用。吸取500L试样液于2mL具旋盖离心管中，加入200μL淀粉葡糖苷酶溶液（约U/mL）,50μLβ-半乳糖苷酶溶液（4000U/mL），涡旋混合30S，在60℃水浴中保温120min，随180
后水浴温度升至100℃保温5min，取出置于4C冷却10min。吸取20uL混合溶液于2mL离心管中，加入200L2-氨基苯甲酰胺衍生溶液，涡旋混合30s，在60℃水浴中保温120min，取出放至室温，加入1mL乙睛溶液（75%），混匀后6000r/min离心5min，上清液用0.22μm有机微孔滤膜过滤后，供高效液相色谱测定。
A.4.2.2空白试验
称取与试样相同质量的水，以下步骤按A.4.2.1与试样同时处理。A.4.3仪器参考条件
同5.2。
A.4.4标准曲线的制作
将混合标准系列工作液衍生液分别注入高效液相色谱仪中，测定不同聚合度麦芽糖类标准品衍生物色谱图峰面积，以混合标准系列工作液中的麦芽糖类标准品浓度为横坐标，以同聚合度麦芽糖类标准品衍生物的峰面积为纵坐标，绘制不同聚合度麦芽糖类标准品衍生物标准曲线。A.4.5试样溶液的测定
将试样溶液注入高效液相色谱仪中，参考附录D确定不同聚合度糖的保留时间段，分别记录各聚合度糖衍生物的峰面积之和以及麦芽糖衍生物峰面积，根据对应聚合度标准品衍生物的标准曲线分别计算试样溶液中不同聚合度糖的浓度，根据麦芽糖标准品衍生物的标准曲线计算试样溶液中麦芽糖的浓度。
A.5分析结果的表述
试样中其他低聚还原性物质含量W按公式（A.1）计算。W=（pm—poP±克#）×V×1000
m×1000X1000
式中：
W——试样中其他低聚还原性物质含量，单位为克每千克(g/kg);.........(A..)
PpPi—由标准曲线得到的不同聚合度糖衍生物的浓度，单位为微克每毫升（μg/mL)(i=2~7);一一空白试样溶液中衍生物的浓度，单位为微克每毫升（ug/mL)po
P麦芽糖试样溶液中麦芽糖衍生物的浓度，单位为微克每毫升（ug/mL)：V
一一试样定容的体积，单位为毫升(mL);1000一一换算系数；
m——试样的质量，单位为克(g)。以重复性条件下获得的2次独立测定结果的算术平均值表示，计算结果保留3位有效数字。A.6鉴别规则
GB5009.2892023
其他低聚还原性物质含量大于定量限3.0g/kg，则视为样品中含有其他低聚还原性物质，A.7其他低聚还原性物质
本标准列出其他常见低聚还原性物质，但不限于此，如低聚异麦芽糖、低聚木糖、聚葡萄糖、果葡糖浆、玉米糖浆、神经节苷酯、2-岩藻糖基乳糖、3-岩藻糖基乳糖、乳糖-N-新四糖、3’睡液酸化乳糖、6”-睡液酸化乳糖。如含有该类物质，且含量大于3.0g/kg，则视为样品中含有其他低聚还原性物质，无需再单独验证方法适用性。
5009.2892023
流动相洗脱程序见表B.1。
时间/min
附录B
流动相洗脱程序
流动相梯度洗脱程序
流动相A/%
流动相B/%
附录C
标准溶液和试样溶液衍生物色谱图C.1标准溶液衍生物色谱图见图C.1。响应
麦芽糖衍生物
乳糖衍生物
麦芽三糖衍生物
麦芽四糖衍生物麦芽五糖衍生物GB5009.2892023
麦芽六糖衍生物麦芽七糖衍生物20
图C.1100ug/mL
试样溶液衍生物色谱图见图C.2。响应
乳糖衍生物
麦芽糖行
标准溶液衍生物色谱图
图C.2试样溶液衍生物色谱图
GB5009.2892023
D.1原理
液相色谱-质谱法确定不同聚合度糖保留时间段方法试样中的低聚半乳糖（n为2~～7）经水溶液提取、2-氨基苯甲酰胺衍生，用淀粉葡糖苷酶酶解去除麦芽糊精、淀粉干扰后，用液相色谱串联质谱测定。提取不同聚合度糖衍生物的总离子流以确定不同聚合度糖保留时间段。
D.2试剂和溶液
同第3章。
D.3仪器
D.3.1液相色谱-质谱仪。
2天平：感量为0.1mg和1mg。
pH计：精度为0.01。
D.3.4涡旋混合器。
恒温水浴锅。
5离心机。
D.4分析步骤
样品及标准溶液前处理
同第5章。
仪器测定参考条件
D.4.2.1色谱条件：与5.2液相色谱测定的条件保持一致。推荐柱后2:1分流。D.4.2.2质谱条件：推荐高分辨质谱仪。参考条件如下：
a)ESI源；
b）负离子模式检测；
全扫描模式扫描：
d）扫描范围：100m/z~1500m/z。推荐质谱参数：
喷嘴电压1000V;
毛细管电压3500V：
碰撞电压为130V；
锥孔电压65V；
干燥气温度350℃；
干燥气流速5L/min；
雾化器压力45psi(1
鞘气温度350℃：
9kPa);
鞘气流速11
溶液测定
GB5009.2892023
将试样溶液注入液相色谱一质谱仪中，测试得到相应的不同聚合度糖衍生物的信号响应，同时将标准溶液衍生溶液入液相色谱一质谱仪中，测试得到不同聚合度标准品衍生物的信号响应。D.5
时间段判定方法
对不同聚合度糖衍生物的总离子流图进行分析，提取负离子模式下不同聚合度衍生物的分子离子数值见表D.1，
按照记录每个聚合度峰起始时间(tpr起始)到结束时间(tpr终止)的规则，确定不同聚合数，
度的时间段(tDPi-Ms),参考图谱见图D.1表D.1
聚合度
不同聚合度糖行生物的分子离子数提取分子离子式
[Cz2H220n+C, HN2-H]
C8Hg20,6+C,HgN2-H
[C24H4
20z,+CHgNz-H-
[Cgol,2026+CHNH]
[Caee20g+C,HN,-H]-
[Cazll,Og6+CHgN,H]-
二糖峰簇
16.2317.63
三糖峰
四糖峰簇
五糖峰簇
41.28/3.63
提取分子离子数(m/z)
六糖蜂巅
七糖峰族
44.5945.4745.87
样品行生溶液提取离子流图
如使用不同品牌的高效液相色谱仪，50
需将液相色谱一质谱法测定的麦芽糖衍生物的保留时间(t麦芽糖-Ms)与液相色谱法测定的麦芽糖衍生物的保留时间(t麦芽糖HPLc)进行校正，得出不同仪器间的相对
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