【GA公共安全标准】 中毒检材中安定、利眠宁的定性及定量分析方法

ICS13.310
中华人民共和国公共安全行业标准GA/T188-1998
上海市技术疏督情报研究所
登号QT994438
中毒检材中安定、利眠宁
的定性及定量分析方法
Methods of qualitative and quantitative analysis fordiazapam and chlordiazepoxide in cases samples1998-12-08发布
中华人民共和国公安部发布
1999-03-01实施
GA/T188—1998
安定、利眠宁在中毒案件、事件中是较为常见的药物。1985年，1989年和1993年，公安部第二研究所分别对中毒案件生物检材中安定、利眠宁的定性及定量分析方法进行了专门研究，选用的分析方法经过了几年的办案运用和举办培训班的验证，在此基础上起草了“中毒检材中安定、利眠宁的定性及定量分析方法标准。本标准适用于中毒案件、事件中血、肝、胃、脑、胆汁、尿液以及其他现场所有物证中安定、利眠宁药物的定性及定量分析。本标准采用国际上先进的质量控制方法。为适应不同条件的各级实验室需要，本标准分别制定了TLC、GC、HPLC的分析方法，以供选用。本标准的主要内容有方法原理；仪器、试剂种类；标推样品配制；提取净化操作程序、分析步骤；计算方法及结果评价。本标准的分析方法是，在1mL血液中加人5药物，安定和利眠宁药物回收率可达80%左右，定量重复性好，可检测体内治疗量以上的药物。本标准的附录A和附录B都是标准的附录。本标准由中华人民共和国公安部提出。本标准由全国刑事技术标准化技术委员会归口。本标准起草单位：公安部第二研究所。本标准主要起草人：李双庆、封世珍、王芳琳。1范围
中华人民共和国公共安全行业标准中毒检材中安定、利眠宁
的定性及定量分析方法
Methods of qualitative and quantitative analysis fordiazapam and chlordiazepoxide in cases samplesGA/T188-1998
本标准规定了安定、利眠宁药物引起中毒案件及事件有关检材进行分析检验的操作步骤、计算方法及结果评价。
本标准适用于中毒后的生物检材及现场物证的定性及定量分析。本标准需提供的检材为：中毒者的血、尿；中毒死亡者的血、肝、肾、脑、胃、胃内容物、肺、脾、胆汁等；对怀疑注射进药者，还需提供注射部位肌肉；同时还需提供可疑含有药物的其他物证。2引用标准
下列标准所包含的条文，通过在本标准中引用而构成为本标准的条文。本标准出版时，所示版本均为有效。所有标准都会被修订，使用本标准的各方应探讨使用下列标准最新版本的可能性。GA/T122-1995毒物分析名词术语3定义
本标准采用GA/T122的定义。
第一篇气相色谱法（GC法）
4原理
本方法采用在生物检材中加人内标药物，经提取、净化后，用具有氮磷检测器（NPD)或火焰离子化检测器（FID）的气相色谱仪测定其中药物。经与药物标准品对照，以保留时间RT或相对保留时间RRT值作定性分析；并与平行操作提取的标准品比较，以峰面积或峰高值为依据，用内标法（或外标法）进行定量分析。
5试剂
5.1乙醛、氮仿、无水乙醇、异丙醇。5.2GDX403固相柱（GDX103柱）：40～60目，使用前用5mL甲醇淋洗，再用5mL蒸馏水淋洗使其活化。
5.320%和1%氢氧化钠水液。
5.46mol/L，1%盐酸溶液。
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1999-03-01实施
GA/T188—1998
5.5pH6溶液：6g磷酸二氢钠溶于450mL去离子水中，用1.0MNaOH调至pH6.0士0.1后定容至500mL
5.6碳酸钠。
5.7pH9.5缓冲液：1mol/L碳酸氢钠溶液用1mol/L碳酸钠水溶液调至pH值为9.5。5.8单一药物标准储备液：精密称取安定、利眠宁药物标品各50mg，分别装于50mL棕色容量瓶中，用无水乙醇溶解并稀释至刻度，混勾，得每毫升含1.0mg的药物标准储备液，置一10C冰箱中保存，此储备液可使用0.5a。
5.9单一药物标准工作液：分别取单一药物储备液用乙醇稀释成0.50mg/mL、0.050mg/mL（NPD用）的工作液，置4℃冰箱中保存，使用期限10d。5.10内标物储备液：精密称取内标物SKFs25A50mg装于50mL棕色容量瓶中，用无水乙醇溶解并加至刻度，混匀，得每毫升含1.0mg的内标物乙醇液，置一10℃冰箱中保存，此储备液可使用1a。5.11内标物工作液：取内标物储备液用无水乙醇稀释成0.50mg/mL、0.050mg/mL的工作液，置4℃冰箱中保存，使用期限10d。5.12混合药物标准工作液：分别取单一药物1.0mg/mL的储备液装于同一个棕色容量瓶中，加无水乙醇稀释至含各药物及内标物各0.050mg/mL的工作液，置4C冰箱中保存。以上配制的标准工作液只适用于NPD检测器。如果选用FID检测器分析，标准工作液浓度应增加10～20倍。使用期限10d。6仪器及器材
6.1气相色谱仪：具有氮磷检测器或火焰离子化检测器的气相色谱仪，并配有色谱数据处理机。6.2振荡器。
6.3水浴锅（或加热块）。
6.4快速液体混合器。
6.5微量注射器：10μL，100μL。7操作方法
7.1定性分析
7.1.1提取与净化
7.1.1.1液一液萃取法
取检材血2mL（或尿5mL，胃内容物、胃、肝各2g）装于15mL具塞试管中，加人内标物工作液100μL（0.05mg/mL）（如用FID检测器进行分析，应添加0.5mg/mL的药物标准液100μL），混勾。另取一份相应的空白脏器作空白对照。在所有样品中加0.5mLpH9.5的缓冲液混勾；加7mL乙醛振荡提取5min，离心5min。分出乙醛装于小烧杯中，检材再用7mL乙醚提取5min，离心5min（2000r/min），乙醚液合并于烧杯中，在50℃水浴上将乙醚挥干，立即取出。共用8mL1%盐酸分3次溶解，依次经滤纸过滤到10mL具塞试管中。在试管中加人2mL石油醚，振荡3min，离心5min。用吸管吸出石油醚并弃去。盐酸液用固体碳酸钠约0.3g调节pH为8左右，再加0.5mLpH9.5缓冲液，混勾。加2.0mL氯仿振提5min，离心5min，用吸管吸出上层碱液并弃去，底层氢仿液转移至另一个干净的尖底试管中，置80C水浴挥干。提取物用100μL乙醇溶解，供分析。7.1.1.2液固萃取法
7.1.1.2.1血、尿等液体样品：取血1.0mL、尿10mL，各加内标物工作液50μL（0.05mg/mL），加PH6的溶液10mL，混勾并同时做空白对照。所制备的样品液通过活化好的固相柱，使流速为1~2mL/min。样品液流完后用5mL蒸馏水洗涤，最后抽干柱中残留水份，用4~6mL氯仿/异丙醇（8：2）洗脱，在60～70℃下挥干洗脱液，用50～100μL甲醇溶解，供GC/NPD分析。2
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7.1.1.2.2胃、肝等固体样品：取绞碎的固体检材1～2g，加内标物10g，用10mLpH6的溶液振提12h，离心，滤纸过滤，得样品液。胃、肝等固体脏器也可用水解法：取1~2g检材，加内标200μL（0.05mg/mL），加6mol/L盐酸1mL，蒸馏水4mL，在90~100℃下水解1h，冷后离心，过滤，滤液用20%和1%NaOH调为pH6左右，得样品液。
以上样品液按7.1.1.2.1过固相柱的方法及步骤进行。液一固萃取法应同时做空白对照，7.1.2气相色谱分析参考条件
a）填充色谱柱
色谱柱：玻璃柱2m×2mm(i.d）：固定液及担体：2%OV-17涂于100~200目ChromosorbWHP上；检测器：氮磷检测器(NPD)或火焰离子化检测器(FID)；温度：柱温240℃、汽化室280℃、检测器280℃；载气（N，）：30mL/min，氢气（H2）：3.5mL/minAir：100mL/min。b）毛细管色谱柱
色谱柱：BP-1弹性石英毛细柱，25m×0.25mm；检测器：氮磷检测或火焰离子化检测器：5℃/miz280℃(1min);
温度：240℃（1min）
载气（N2)：2.5mL/min.Air：100mL/min、氢气（H)：3.5mL/min尾吹（Nz）25mL/min。7.1.3检测方法
7.1.3.1进样
将检材和对照样品提取液1～3L注人前述条件的色谱柱，每个样品进样2～3次并同时注人混合药物标准工作液和内标工作液。7.1.3.2记录
分别记录各样品中药物及内标物的保留时间（RT），并记录添加于检材中内标物及等量内标物工作液在相同条件下的峰面积值。
7.1.3.3计算
计算各药物标准品及检材中各药物保留时间（RT)平均值，以内标RT为1，计算各药物RRT平均值。
计算内标物的回收率：
检材中内标物峰面积平均值
等量内标物标准液峰面积苹玛值×100内标物回收率（%）=
7.2定量分析
7.2.1提取与净化
精密量取血液1～2mL，称取绞碎的肝组织等1～2g各2份，置于15mL具塞试管中。另取相应的空白脏器添加待测药物各2~10μg（如果选用FID检测器进行分析，应添加0.50mg/mL的药物标准100μL）。在检材及空白添加样品中各加人内标物2～10μg，若选用FID检测器分析，应加100μL0.50mg/mL的标准液。以下操作选7.1.1中的一种方法进行。7.2.2分析条件同7.1.2。
7.2.3测定方法
7.2.3.1进样
将2份检材提取浓缩液及1份添加标准品提取浓缩液分别进样，根据其含量每种检材进样1～3μL，各进样2~3次。
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7.2.3.2记录
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记录检材及空白添加标准品中待测药物及内标物的平均峰面积值，并算出各检材中内标物及药物的平均峰面积值。
7.2.4色谱图
见附录A（标准的附录）。
7.2.5计算分析结果
a）计算相对校正因子f
添加于空白中待测药物进样量（g）×内标峰面积平均值f=
添加于空白中内标进样量（ug）文空白中待测药物峰面积平均值b）计算检材中药物含量
药物含量 X(mg/100 g）= /×检材中待测药物峰面积平均值X内标添加量(μg) × 100检材中内标峰面积平均值×检材重量（g）×1000c）计算相对相差
相对相差(%) =xl× 100
式中：X,、X2—两份检材平行定量测定的数值；x—两份相同检材含量的平均值。8结果评价
8.1定性分析结果评价
8.1.1如果添加于检材中的内标物SKF525A回收率在50%以上，检材中未出现安定、利眠宁药物色谱峰，可认为检材不含这两种药物，阴性结果可靠。如果内标物回收率在50%以下，检材未出现安定、利眠宁药物色谱峰，属操作有误，阴性结果不可靠，应重新实验。8.1.2检材中若出现安定、利眠宁药物色谱峰，应重选分析条件，结果均一致时可以判断检材中含有这两种药物。
8.1.3如果空白脏器经提取后未出现安定、利眠宁相应色谱峰，而检材有相应色谱峰，说明空白无干扰，阳性结果可靠。如果空白脏器有安定、利眠宁相应色谱峰，说明空白有干扰，即使检材有相应色谱峰，结果也不可靠，应选用其他方法进行验证。8.2定量分析结果评价
定量分析时，同一检材的2份平行样品相对相差不超过20%时，其结果按2个样品平均值计算，如果相对相差超过20%，其结果不精确，应重新实验。第二篇
高压液相色谱法（HPLC法）
9原理。
生物检材中的安定、利眠宁药物经提取、净化后，用配备二极管阵列检测器（DAD）或紫外检测器（UV)的液相色谱仪进行检测，与药物标准品比较，以RT或RRT值进行定性分析；与平行操作提取的药物标准品比较，以峰面积或峰高为依据进行定量分析。10试剂
10.1乙腈（优级）。
10.2磷酸二氢钾（优级）。
10.3磷酸（优级）。
10.4二乙胺（分析纯）。
10.5去离子水或二次重蒸水。
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10.6流动相：乙腈：0.02mol/LKH,PO。水溶液（含1%二乙胺，磷酸调pH3.0)=2：3.3。11仪器
11.1液相色谱仪：配备二极管阵列检测器（DAD)或紫外检测器（UV）的液相色谱仪，并配色谱数据处理机。
11.2其他仪器同6.2~6.5。
12操作方法
12.1定性分析
12.1.1提取与净化
操作步骤同7.1.1，选用其中一种方法提取与净化，提出物用100μL流动相（2：3.3)溶解，供分析用。
12.1.2分析条件
色谱柱：ODSC1s不锈钢柱（15cmX4.6mm）；流速：1.5mL/min；
检测波长：210nmC波长选择可依据仪器情况而定，除210nm外还可选择其他波长，但不能大于235nm（因为内标物SKFs25A在235nm以后无紫外吸收）；柱温：室温。
12.1.3检测方法
12.1.3.1进样
将流动相溶解的检材样品及空白对照品10～20μL注人上述条件的液相色谱仪中，每个样品进样2～3次，并注人混合药物工作液。12.1.3.2记录
分别记录各样品中内标及药物的保留时间（RT）值，并记录添加的内标物及等量内标物纯品工作液在相同条件下的峰面积或峰高值。12.1.3.3计算同7.1.3.3。
12.1.4色谱图
见附录A。
12.2定量分析
12.2.1提取与净化同7.2.1。
12.2.2分析条件同12.1.2。
12.2.3测定方法同12.1.3。
12.2.4计算分析结果同7.2.4。
13结果评价
结果评价同第8章。
14原理
第三篇
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薄层色谱法（TLC法）
检材中的安定、利眠宁药物经提取、净化、浓缩、薄层色谱分离后，用碘化铋钾试剂显色，与添加提取的标准品或药物纯品比较，根据R值作为定性分析的依据。15试剂
15.1硅胶GF254薄层板或高效硅胶GF254薄层板。15.2碘化铋钾显色剂：次硝酸200mg，加碘化钾5g、碘2g，加1.0mL浓盐酸、1.0mL冰醋酸，再加蒸馏水到250mL，摇匀即得。
15.3苯、环己烷、二氧六环、二乙胺均为分析纯或化学纯。15.4其他试剂同第5章。
16仪器及设备
除6.26.5外，还需以下仪器：
16.1点样毛细管。
16.2展开缸。
16.3254nm波长紫外灯。
17操作方法
17.1提取与净化
17.1.1取检血、胆汁、胃内容物、胃组织、肝组织各5g，尿液10mL，置于100mL三角烧瓶或分液漏斗中。另取相同量的空白脏器添加安定、利眠宁各100μL（1.0mg/mL）。17.1.2加0.5mLpH9.5缓冲液，混勾，调节pH值为9.5左右。17.1.3加50mL乙醚振提10min，分出乙醚液于另一个100mL分液漏斗中，再加30mL乙醛振提10min，分出乙醚合并到第一次提取的乙醚液中。17.1.4用1%（或0.25mol/L）NaOH溶液5mL洗涤1~2次，每次振1min左右，静置分层并弃去水液层。再加10mL蒸馏水洗涤1min左右，静置分层并弃去水液。17.1.5乙醚加5mL2mol/L盐酸振提5min，彻底分层后，分出酸液层于另一分液漏斗中，再用5mL2mol/L盐酸反提1次，合并两次酸液。17.1.6反提酸液用5mL20%NaOH调节pH值为8左右，再加0.5mLpH9.5缓冲液。17.1.7碱液用10mL氯仿反提两次，每次振荡5min，合并氯仿液并浓缩至干。17.1.8提取物加50uL甲醇溶解，供薄层色谱分析。17.2点样
距薄层板底部1.5～2cm，间隔1.0～1.5cm处点一定量的提取液及标准溶液。17.3展开
在展开缸中放人下列展开剂的其中一种，待饱和后，将点好样品的薄层板放人缸中展开。当展至7～10cm左右时，取出自然挥干溶剂。展开剂：环己烷：苯：二乙胺（15：3：4）苯：二氧六环+二乙胺（7：2：1)氯仿：无水乙醇（18：1）
17.4观察荧光
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将挥干溶剂后的薄层板置254nm波长紫外灯下观察，记录位置。17.5显色
用碘化铋钾试剂喷雾或浸渍法显色，待本底退去后观察并记录R值及颜色。安定、利眠宁呈橙黄色。
17.6分析结果
见附录A。
18结果评价
18.1添加在空白脏器中的安定或利眠宁药物经薄层展开显色后，如估量的回收率在50%左右，检材中无论阳性或阴性结果均可靠；如添加样品未出现斑点或回收率低于50%时，阴性结果不可靠，应重新实验。
18.2用碘化铋钾试剂显色，户碱等内源性杂质也会出现橙黄色斑点，定性时要注意区分并注意药物是否包含在杂质中，结合空白对照予以判断。18.3用薄层色谱方法分析，必须选择两种以上不同极性的展开剂，且斑点边缘清晰方可确认。必要时应用气相色谱法、高压液相色谱法或气相色谱/质谱联用法验证。GA/T188—1998
附录A
（标准的附录）
安定、利眠宁色谱分析数据
A1安定、利眠宁气相色谱、液相色谱分析图如图A1所示。
A：气相色谱分析图
B：商压液相色谱分析图
1一内标物SKFssA（5.369min）
2—安定（6.341min）；
3—利眠宁（6.886min）
A2薄层色谱分析R,参考值
如表A1所示。
利眠宁
1一利眠宁（1.495min）；
2一安定（6.61min）；
3--内标SKFs25a（9.997min）
展开剂系统
A3安定、利眠宁回收率参考值
如表A2所示。
液一液提取
液一固提取
B1中症状
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2mL血加2μg药物
2g肝加10μ药物www.bzxz.net
1mL血加1.0μg药物
附录B
（标准的附录）
安定、利眠宁中毒诊断参考资料利眠宁
安定、利眠宁的中毒症状和一般安眠镇静药相同。服用大剂量利眠宁或安定都可使中枢神经系统及心血管抑制，它们的共同中毒症状是嗜睡、昏迷、血压降低：也可出现共济失调、手震题、皮疹、恶心、呕吐、便秘；个别人发生兴奋、多言、语言不清，严重者呼吸抑制、休克。中毒原因一般是长期服用或偶然大剂量服用，以致引起中毒。中毒虽多，但直接中毒死亡率较低。B2代谢情况
B2.1利眠宁
利眠宁口服后能迅速吸收，2～4h后血液中浓度达高峰，但排泄较慢，停药数天后仍有药物从尿中排出。利眠宁在血清中的半衰期为20～40h，尿占排泄剂量的60%，粪便占20%。利眠宁的主要代谢物是N-去甲基利眠宁和去氧安定。B2.2安定
内服安定后很快吸收并分布到组织内，排泄缓慢，经16d后常有内服量的71%出现在尿中，10%在粪便内。代谢产物主要是N-去甲安定，N-去甲羟基安定和3-羟基安定。B3中毒浓度参考值
关于安定、利眠宁药物治疗、中毒浓度有不少资料报道，本数据摘自中国刑事替察学院的《毒物分析》，可供办案时参考（见表B1)。表B1
治疗量
利眠宁
治疗量
0.005~0.02
0.0025~0.005
血浓度
mg/100ml
中寿量
中毒量
血浓度
mg/100mL
致死量
致死量
血浓度
mg/100mL
0.1~0.5g/kg
中华人民共和国公共安全
行业标准
中毒检材中安定、利眠宁
的定性及定量分析方法
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中国标准出版社出版
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开本880X12301/16印张1字数19千字1999年7月第一版1999年7月第一次印刷印数1-600
书号：1550662-12599
定价10.00元
标目379-50
8661887/
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