【GB国家标准】 天然胶乳医用手套水抽提蛋白质的测定改进Lowry法

ICS83.040.10
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中华人民共和国国家标准
GB/T21870—2008/ISO12243:2003天然胶乳医用手套水抽提蛋白质的测定改进Lowry法
Medical gloves madefrom natural rubber latex-Determination of water-extractable protein using the modified Lowry method(ISO12243.2003，IDT)
2008-05-14发布
中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中国国家标准化管理委员会
2008-10-01实施
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GB/T21870—2008/ISO12243.2003本标准等同采用ISO12243:2003《天然胶乳医用手套水抽提蛋白质的测定改进Lowry法》（英文版）。
本标准等同翻译ISO12243：2003。为便于使用，本标准做了下列编辑性修改：a）“本国际标准”一词政为“本标准”；b）用小数点“，\代替作为小数点的逗号“，”。附录A、附录B为规范性附录，附录C、附录D为资料性附录。本标准由中国石油和化学工业协会提出。本标准由全国橡胶与橡胶制品标准化技术委员会胶乳制品分技术委员会（SAC/TC35/SC4）归口。
本标准主要起草单位：江阴嘉乐威胶乳制品有限公司、湛江出人境检验检疫局、湛江嘉力手套制品有限公司、江阴出人境检验检疫局、北京市医疗器械检验所、中橡集团株洲橡胶塑料工业研究设计院。本标准主要起草人：徐永平、云俊、周松茂、高乃东、岳卫华、康敏静、郭平、李枚辉。本标准为首次发布。
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GB/T21870—2008/ISO12243.2003ISO前言
国际标准化组织（ISO）是各国国家标准团体（ISO成员团体）的世界性联合机构。制定国际标准的工作通常由ISO技术委员会进行，凡对已建立了技术委员会项目感兴趣的成员团体均有权参加该委员会，与ISO有联系的政府或非政府的国际组织也可参加此项工作。在电工技术标准化的所有工作中，ISO与国际电工委员会（IEC)紧密合作。本国际标准是根据ISO/IEC导则第2部分起草的。技术委员会的主要任务是制定国际标准。技术委员会采纳的国际标准草案应下发到各成员团体投票，作为国际标准发布时，要求至少有75%的成员团体投赞成票。应对本文件中的某些部分是专利权主题的可能性引起注意，ISO没有识别任何或所有专利权的责任。
国际标准ISO12243由橡胶与橡胶制品技术委员会橡胶工业用原材料（包括胶乳）分技术委员会（ISO/TC45/SC3）制定
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GB/T21870—2008/ISO12243:2003天然胶乳医用手套水抽提蛋白质的测定改进Lowry法
誉告一一本标准使用者应熟悉一般实验室操作。本标准不涉及任何安全性问题，即使是与它有关的也不例外，使用者应建立相应的安全和健康规范，并使之符合国家的规定。1范围
本标准规定了天然胶乳医用手套水抽提蛋白质含量的测定，也适用于其他天然胶乳制品中水抽提蛋白质含量的测定，但抽提过程和次数没有得到证实，会随试验样品类型不同而变化。附录C介绍了医用手套中几种特种蛋白质的其他测定方法，但不具有通用性。本标准仅涉及分析方法，与取样无关，也不涉及测定结果的安全性或标志要求。2规范性引用文件
下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GB7543-2006次性使用灭菌橡胶外科手套（ISO10282:2002,IDT）GB10213—2006一次性使用医用橡胶检查手套（ISO11193-1：2002，IDT）3原理
用缓冲溶液抽提水溶性蛋白质，然后通过沉淀、浓缩，将其从有可能干扰测定的其他水溶性物质中分离出来（见附录A和附录D)：再溶解沉淀的蛋白质，以标准蛋白质做参照，用改进Lowry方法进行比色，定量测定蛋白质含量（该方法的概述见参考文献[1])。4术语和定义
下列术语和定义适用于本标准。4.1
浓缩因子Fconcentration factor沉淀蛋白质所用抽提液体积与再溶解蛋白质沉淀所用氢氧化钠溶液的体积比。注：用4mL蛋白质抽提液进行沉淀，然后用0.8mL氢氧化钠溶液再溶解沉淀，则浓缩因子F为：4/0.8=5。4.2
蛋白质protein
存在于天然胶乳制品中并可用水进行抽提的蛋白质与蛋白质类似物质（如多肽）。4.3
改进Lowry方法
modified Lowrymethod
原Lowry分析方法的改进，通过对蛋白质进行沉淀和分离，减少了其他可抽提物在测定中可能产生的干扰。
5设备
除另有说明外，所有的实验室用器血（如烧瓶，试管等）均为聚丙烯或聚乙烯制造。注：案丙烯或聚乙烯器血比玻璃器血对蛋白质的吸附量小，蛋白质吸附量的测定方法见附录B，1
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GB/T21870-2008/ISO12243.20035.1无蛋白质手套
由合成胶乳或塑料制造、无粉且不含其他可转移到试样或抽提液中的物质的手套。5.2离心机
性能至少达到60.000m/s（6000g）。注：当离心时间延长时，温度可能会上升，最好用冷冻离心机。5.3离心管
容量为200mL、50mL、10mL、2mL，1.5mL蛋白质吸附量少的聚丙烯或聚乙烯（如果适用）离心管。
5.4锥形瓶
容量为250ml。
5.5微量移液器。
5.6试管振动器
振动频率为3Hz～6Hz。
5.7漩涡混合器或超声波仪
5.8一次性使用滤膜
蛋白质吸附量少且孔径为0.45m或更小的滤膜。5.9夹持器
在抽提过程中用来夹持手套并保持不漏水的设备，夹持器可为一对与泡沫橡胶连接的能用螺钉拧在一起的铝条，或者为血液透析用170mm长的塑料夹具。5.10分光光度设备
5.10.1分光光度计
带有一次性使用的聚苯乙烯透明比色皿（可用石英材质但要求十分干净）。5.10.2酶标仪
96孔容量为0.25mL～0.5mL的聚苯乙烯平底酶标仪。注：最好使用容量0.5ml的孔板，也可用较小容量的孔板，但会降低分析灵敏度。5.11天平
精确到0.0001g。
6试剂bzxz.net
试验过程中，使用试剂均为分析纯和蒸馅水或去离子水。6.1染色剂：溴苯酚蓝（钠盐），将0.1g溴苯酚蓝溶于1L水中，有效期为4周。6.2抽提液：在整个抽提过程中pH值能保持在7.4土0.4范围内的一种缓冲溶液。注1：适用的缓冲溶液包括0.01mol/L的磷酸盐缓冲溶液(PBS)和0.1mol/L的N-(羟甲基)-甲基-2-氨基乙磺酸钠盐缓冲溶液（TES)。磷酸盐缓冲溶液的制备是根据产品说明将磷酸盐溶解于蒸馏水中，如果缓冲溶液的PH值达不到7.4士0.4，有必要使用浓度高一点的磷酸盐落液。TES缓冲溶液的制备是将24gTES落于500mL的水中，然后用水稀释至1L。注2：PBS和TES容易从市场获得。6.3改进的Lowry蛋白质分析试剂6.3.1试剂A：碱性柠檬酸铜溶液，将10份试剂C和0.2份试剂D混勾，在检验的当天配制。也可使用碱性酒石酸铜，同样应在检验的当天配制。成套试剂中则会含有可能影响检测的未加说明的保护剂。
6.3.2试剂B：用28mL水加人72mL2mol/L的福林试剂后得到的稀溶液。注：2mol/L的福林试剂可从市场上购实，例如：可从美国西格玛化学公司（Box14508，StLouis，MO63178）获得（目录号F9252），有些工业用高浓度的福林试剂可能达不到2moI/L2
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6.3.3试剂C：6g碳酸钠溶解在100mL水中的溶液。GB/T21870—2008/1SO1224320036.3.4试剂D：1.5g硫酸铜和3g柠檬酸钠溶解在100mL水中的溶液。6.3.5氢氧化钠溶液：c(NaOH）=0.2mol/L。6.3.6脱氧胆酸钠溶液（DOC）：用水溶解0.15g脱氧胆酸钠稀释至100mL后的溶液。冷戴贮存，有效期为4周
6.3.7三氯乙酸（TCA)）溶液：用水溶解72g三氯乙酸稀释至100mL并混合均匀的溶液。冷藏贮存，可稳定贮存较长时间。
6.3.8磷钨酸（PTA)溶液：用水落解72g磷钨酸至100mL后的溶液。混合均匀，贮存在冷藏室中，有效期为4周。为了方便，可将TCA和PTA溶液按7.4.2步骤同时等体积比进行预混合，这种混合落液缺少贮存期数据，只能在检验的当天混合。6.4卵清蛋白贮备液：卵清蛋白是用硫酸铵分馏并在pH=4.5时重复结晶所得。例如：可从美国西格玛化学公司（Box14508，StLouis，MO63178）获得（目录号A5503）。将100mg卵清蛋白溶解于100mL的抽提液（6.2)）中制备成浓度为1mg/mL的贮备液，将溶液用0.45um（或更小的孔径）低蛋白质吸附量的滤膜（5.8）过滤，用紫外分光光度计，以光程为1cm的比色在280nm波长处测定蛋白质的吸光度，以抽提液（见6.2）作为空白样，然后将吸光度除以0.64\得到卵清蛋白贮备液的精确浓度。在不高于7℃条件下，溶液可稳定贮存48h，或在一10℃条件下可冷冻贮存2个月：融化时要求加热到45℃并保温15min。注：冷载时间为累计时间。为避免反复冷冻和融化，建议将蛋白质贮备液分儿份忙存，每份足够制备一条校准曲线，或在验证试验步骤中足够使用（见附录A)。7抽提步骤
7.1原理
试验步骤包括整只手套的抽提、抽提液的提纯和浓缩。使用按同样方法浓缩的蛋白贮备液（见6.4和7.3）的稀释液绘制标准曲线，对照标准曲线，测定抽提液中的蛋自质浓度。分析人员的操作技能必须按附录A进行证实。
在给定批中抽取3只或3双手套按3份进行平行测定每份抽提液独立进行提纯、浓缩及最后的测定。
7.2抽提
7.2.1概述
在（25土5)℃条件下，将手套表面完全展开在抽提液中抽提（120士5）min。可以按“剪碎手套”和“手套套手套”两种抽提方法进行抽提。在检测报告中须注明所用的抽提方法，同类样品均应用同一方法进行抽提。抽提时应进行3个平行试验，对每份抽提液应单独进行测定。抽提过程中穿戴无蛋白质手套（见5.1)来处理试验手套样品。注：抽样和手套的左右之分不在本标准范围之内。7.2.2方法A-—剪碎手套抽提方法7.2.2.1称量手套质量（m）至少精确到0.001g。7.2.2.2沿边缘将手套剪切，为了便于抽提，允许将手套剪成更小的片（须注意7.2.2.3）。7.2.2.3如果结果以手套每单位面积微克数来表示（如：μg/dm）时，手套表面积按以下步骤测量：在手套背面剪取0.5dm×0.5dm的正方形小片，准确测量尺寸，计算其面积Al。称量正方形小片的质量(mz）精确到0.001B。测试样品手套两面的总面积A由下式计算：A=2A×m/mp。1）卵清蛋白的消光系数精确值是经过证实了的。3
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GB/T21870-2008/ISO12243:20037.2.2.4将手套碎片放人一个合适的锥形瓶（见5.4）中。7.2.2.5准确加入适量体积为V的抽提液（见6.2)，每克手套抽提液的用量在10mL~15mL之间，使之能完全浸泡手套碎片。
7.2.2.6在（25土5）℃C条件下，将手套样品抽提120士5）min。开始时搅动试片15s，然后不超过30min搅动次，最好连续缓慢搅动。7.2.2.7将抽提液移人离心管中，在不低于20000m/s（2000g）的条件下离心15mim，将固体物离心分离。分离出的抽提液最好立即试验，但也可以在不高于7℃条件下贮存48h，或者在低于一10℃条件下冷冻贮存15d。
7.2.3方法B—手套套手套抽提方法7.2.3.1取两只手套并准确称量每只手套的质量（m，和m，），至少精确到0.001g，在每只手套从中指顶端沿袖口边方向20cm处作个标记，取一只手套并将其插人另一只手套里面使它们贴合在一起（为了方便可使用一根杆将大拇指套插人另一个手套的大拇指套里面，其他指套也可用类似方法，然而，这个步骤并不是关键，只要能使两只手套的展开尽可能简化）。使用同一规格另外两双手套重复上述操作。7.2.3.2往里层手套中加足量的染色剂（6.1)充满每个手指为止，在里层手套与外层手套之间加入25mL的抽提液（6.2)，轻缓赶走抽提液里面的气泡，并在20cm标记处用夹持器（5.9）封住手套。7.2.3.3将手套固定在一个振荡器上，在（25土士5）℃条件下振动（120士5）min，如外面手套的表面出现小液滴，表明外层手套有孔洞，应丢奔该样品并取另一双手套重新抽提。7.2.3.4抽提结束后，移走夹持器并小心地将手套分开，注意不能让里层手套中的染色剂污染抽提液。7.2.3.5将外层手套中的抽提液移人离心管（5.3）中，如抽提液被染成蓝色，说明里面手套有针孔或交叉污染。在这种情况下，倒掉溶液用另一双手套重新抽提。将抽提液在不低于20000m/s（2000g）的条件下离心15min，抽提被可在不高于7℃条件下贮存，并在48h内进行测定；也可以在一10℃或以下冷冻贮存15d。
7.2.3.6在20cm处剪掉两个手套袖口边，吸掉袖口边多余的液体并室温干燥，测量袖口边质量（mc）至少精确到0.001。由下式计算手套被抽提部分的平均质量（ms）：ms (m+mz-mc)/2
式中：
m,和m..手套初始质量；
mc未被抽提的两只手套袖口边总质量。7.3蛋白质标准溶液的制备
蛋白质标准溶液的制备是用抽提液（6.2)将蛋白质贮备液（6.4）稀释，制备下列蛋白质标准溶液：40μg/mL.20μg/mL.10μg/mL.5μg/mL和2.5g/mL，同时用抽提液（6.2）作空白。溶液可稳定冷藏2d（见注）。
注：将适当浓度的溶液进行双倍逐级稀释可得到更低浓度的落被，这些标准溶液应有较宽的浓度范围，具体浓度值可通过已知浓度的贮备液（见6.4)得到。这些溶液还要求符合附录A中的验证步骤。7.4蛋白质的沉淀与浓缩
7.4.1总则
在（25士5)℃条件下逐一进行测试。7.4.2分别准确移取4mL抽提液（6.2）（作为一个空白样）、蛋白质标准溶液（见7.3）和3个手套抽提液置于10mL的离心管（5.3）中，各加人0.4mL的DOC（6.3.6），混勾并静置10min，然后各加人0.4mL的TCA（6.3.7)并混匀，再各加人0.4mL的PTA（6.3.8），混勾并再静置30min（见注）。注；溶液量须满足比色分析的需要，如使用酶标仪测定，则可以适当地减少用量。如样本量大，则特别注意清楚标识每个商心普。
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GB/T21870—2008/ISO12243:20037.4.3将离心管在不低于60000m/s（6000g）的条件下离心30min，确保蛋白质充分沉淀，如有必要可延长离心时间。倾去上层清液，将每个离心管倒置在滤纸上，让水流干。在每个离心管中各加人0.8mL浓度为0.2mol/L的NaOH溶液（6.3.5）（包括空白样），用来再溶解蛋白质沉淀，必要时使用漩祸混合器或超声波仪（5.7），使蛋白质沉淀溶解完全确保蛋白质完全再溶解至没清溶液，假如还有蛋白质沉淀，可继续加入定量的不超过3.2mL的NaOH溶液（即总量为4.0mL），在每一个溶液中加人NaOH溶液的量应相同。加人推荐量0.8mL的NaOH溶液时，浓缩因子F为5，如果每个样加人NaOH溶液的量不相同，那么F也不相同：沉淀前抽提液体积
F=溶解蛋白质所用 NaOH溶液体积溶解后的蛋白质溶液最好是当天测定，如测定不能立即进行，则溶液可在不超过7℃的条件下贮存且不超过24h。如果加人4.0mL的Na0H溶液后抗淀还没完全溶解时，可在60000m/s（6000g）的条件下离心15min直至出现澄清蛋白质溶被为止。7.5比色检验
7.5.1按使用说明打开分光光度计并调零。7.5.2分别在0.8mL再溶解蛋白质溶液及空白样（7.4.2)中加人0.3mL的试剂A（6.3.1）并混勾；加人0.1mL的试剂B(6.3.2)混匀，在测定吸光度前至少静置15min但不得超过1h。注：只需0.8mL再溶解蛋白质溶获用于显色反应，不考虑再溶解蛋白质溶液的总体积。如因某些干扰物质的存在导致静置过程中产生沉淀，则应在比色检验前离心至澄清溶液。7.5.3分光光度计测定
加人试剂B后1h内，移取7.5.2准备好的溶液到比色Ⅲ中，在750nm波长处（最好）或在规定波长600nm～750nm范围内对照空白样测定其吸光度。为统一结果，时间范围，仪器和选择波长必须保持一致，测定蛋白质含量时单位为μg/g（见8.3)。7.5.4酶标仪测定
加入试剂B后1h内，移取0.49mL7.5.2制备的溶液到平底酶标板中（见5.10.2），在规定波长600nm～750nm范围内对照空白样测定其吸光度，测定蛋白质含量时单位为ug/g（见8.3）。8结果计算
8.1校准曲线
以蛋白质校准溶液（见7.3)的浓度对应经过沉淀和再溶解（见7.5.3或7.5.4)后吸光度绘制条校准曲线。
注：在浓缩过程中会损耗一些蛋白质。本方法假设在浓缩过程中试样与标准溶液的蛋白质损耗率是一致。8.2浓度计算
3个抽提样中的每个样品浓度c值根据其吸光度直接在校准曲线上读取，单位为μg/mL，结果取中值。
注：在校准曲线不是线性的情况下，其值可通过多项式回归法来计算，采用商用计算机软件描绘曲线并计算未知浓度更实用些。
8.3可抽提蛋白质含量的计算
8.3.1方法A—剪切手套抽提方法用下式计算可抽提蛋白质的含量E，单位为产g/g。E
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GB/T21870—2008/ISO12243:2003式中：
V---抽提液体积，单位为毫升（mL）：c—再溶解蛋白质溶液中蛋白质的浓度，单位为微克每毫升（pg/mL）：F——浓缩因子
m整只被抽提手套的质量，单位为克(g)。注：除非使用NaOH溶液的量不是所推荐的（见7.4.3)，否则式中5/F为1。每只手套中可抽提蛋白质的量可用下式计算，单位为g。每只手套中可抽提蛋白质的量=E×m8.3.2方法B——手套套手套抽提方法用下式计算每克手套中可抽提蛋白质的含量E，单位为μg/g。5Vc
式中：
V—抽提液体积，单位为毫升（mL）；c再溶解蛋白质溶液中蛋白质浓度，单位为微克每毫升（μg/mL)；F浓缩因子
m.—被抽提手套样品质量（见7.2.3.6），单位为克（g）。注：除非使用NaOH落液的量不是所推荐的量（见7.4.3），否则式中5/F为1.每只手套中可抽提蛋白质含量可用下式计算，单位为g。每只手套中可抽提蛋白质的量=E×m式中：
m一整个手套的质量［=（m十mz）/2]，单位为克（g）：m，和m.——双手套相应的初始质量。8.3.3单位表面积质量换算
当结果需要用表面积来表示，例如：g/单位面积。可用下式进行换算，单位为ug/dm2：可抽提蛋白质的含量(μg/dm\）=SVcFA
式中：
A一-被抽提手套总表面积（见7.2.2.3），单位为平方分米（dm）。9精密度
9.1背景
2002年按ISO9272（当时在制定中）中所描述的精密度测定程序和指南进行了一次实验室间比对试验（ITP)来评估本方法的精密度。其他细节和术语可以查阅当时的ISO/TR9272.剪切手套和手套套手套两种抽提方法均通过以下试验进行了评估。为提高测量水平，采用4种原材料在7个实验室进行ITP试验，评估了1型精密度。每两组平行试验中，每组做3个重复试验取平均值作为试验结果，精密度是依据测试结果来给定的，即：两组试验结果中某组的平均值。除有本精密度评估结果确实适用于产品或原材料测试的文件规定外，ITP试验的精密度结果不应作为任何原材料或产品接收或拒绝检验的依据。9.2精密度结果
4个样本的2个抽提过程的每一个精密度结果见表1。这些结果是依据ISO9272中的离群校正和离散删除方法来获得的。下面列举了精密度结果用法的概述，r和R为绝对精密度，r）和（R）为相对精密度，见下面的附加说明。
原材料
原材料
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表1精密度数据
剪切手套抽提方法（方法A)
平均值/（μg/g）
平均值/（μg/g）
实验室内
手套套手套抽提方法（方法B）
实验室内
实验室内标准偏倚（以测量单位计）：重复性，即：实验室内精密度（以测量单位计）：重复率（对平均值的百分比）；33.6
实验室间标准偏倚（各实验室间的差异，以测量单位计）再现性，即：实验室间精密度(以测量单位计)；一再现率（对平均值的百分比）：实验室的数量是去除离散数据的实验室后的数量：重复性和再现性表述如下。
GB/T21870—2008/IS012243.2003实验室间
实验室间
实验室
实验室
重复性：每一种测试方法的重复性或实验室内精密度根据表1中的值已经建立，每一种测试水平（原材料）的重复性或实验室内精密度值也列于表中。两个独立试验结果平均值的差（正确运用本标准获得的值)如大于表中对应的和()值，r用测量单位计，(r)用百分数计，则应认为结果不可靠，即：由不同样本数所致；建议进行相应的分析。再现性：每一种测试方法的再现性或实验室间精密度根据表1中的值已经建立，每一种测试水平(原材料)的再现性或实验室间精密度值也列于表中。不同实验室间的两个独立试验结果平均值的差（以本标准的专用方法获得）如大于表中对应的R和（R）值，R用谢量单位计，（R）用百分数计，则应认为结果不可靠，即：由不同样本数所致；建议进行相应的分析。9.3附加说明
对剪切手套抽提方法而言，分析表明有两个实验室有明显的离群性，虽然根据ISO9272步骤进行离群校正，但重复性和再现性仍相当差，表1中剪切手套抽提方法的结果是删除了两个离群实验室后的数据，也就是5个参与实验室的数据。就手套套手套抽提方法而言，同样也有一个实验室数据离群，得到的精密度差。表1中手套套手套抽提方法的结果是去除一个离群实验室的数据，也就是6个参与实验室的数据。
9.4偏倚
偏倚是指测试结果的平均值与待测物的基准值或真实值之差，由于这些方法不存在基准值，因此，偏倚是不能估算的。
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GB/T21870—-2008/ESO122432003试验报告
试验报告至少包含下列内容：
采用的标准
充分区分测试样品的详细信息
试验结果和试验日期；
所用标准蛋白质的来源和类别；所用缓冲溶液的种类；
抽提方法（方法A或方法B)；
如不是手套制造商的实验室，则注明实验室名称和地址；注明测定中观察到的任何异常现象。A.1概述
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附录A
（规范性附录）
GB/T21870—2008/ISO12243:2003在手套生产中往天然胶乳中加人的表面活性剂，促进剂和抗氧剂等化合物，在测试过程中会对比色检验产生干扰，有些可能会减弱显色，而另一些可能会增强显色。沉淀和再溶解浓缩蛋白质的过程，目的是去除干扰以提纯蛋白质。在这个过程中损耗一定数量蛋白质是不可避免的：为满足检验自的，假定标准落液的蛋白质损耗率与样品抽提液中的蛋白质损耗率相同。
为了保证操作过程中蛋白质损耗最小，要求按以下步骤通过在沉淀与再溶解蛋白质标准溶液过程中，对实际回收量进行测试，验证初次实验室和（或）新实验员的技术能力。A.2原理
通过对蛋白质标准溶液一式两份浓缩，每份溶液分两份进行比色测试，以此来评价操作者工作的一致程度。
A,3步骤
A.3.1未沉淀蛋白质标准溶液的制备用0.2mol/L的NaOH溶液（6.3.5）将卵清蛋白贮备液（6.4）稀释制备成80μg/mL.40μg/mL20μg/mL10μg/mL.5μg/mL的蛋白质标准溶液。A.3.2沉淀用蛋白质标准溶液的制备同样地用抽提液（6.2）将卵清蛋白备液（6.4)稀释，制备成下列浓度的蛋白质标准溶液：40μg/mL20μg/mL、10μg/mL、5μg/mL和2.5μg/mL.A.3.3蛋白质沉淀与浓缩
平行样按7.4步骤，将稀释后蛋白质标准溶液（A.3.2)沉淀处理，然后用0.2mol/L的NaOH溶液（6.3.5)再溶解蛋白质沉淀，使每份溶液的浓缩因子F都为5。A.3.4比色检验与定
按7.5步骤，测定非沉淀蛋白质系列溶液的平行样（A.3.1)和沉淀再溶解后的蛋白质系列溶液(A.3.3)的平行样。
A.3.5计算
以未沉淀蛋白质标准溶液的平均吸光度相对应的浓度（见A.3.1)绘制一条校准曲线，利用校准曲线测定沉淀浓缩后蛋白质落液的浓度（见A.3.3），浓度c取4个测试值的平均值（每份标准蛋白质溶液分两份沉淀，比色检测前又分两份，共4个检测值）。A.3.6回收百分率
回收百分率是蛋白质标准溶液（见A.3.2）沉淀前的浓度c/F，对应其起始浓度所得到的百分数。例如：起始浓度为50μg/mL的蛋白质落液，经沉淀与再落解至5倍浓度（F=5)后，浓度c为200/mL，那么c/F=40g/mL并不等于50g/mL，这反映了在过程中有损耗。用真实值的百分数即（40/50）×100=80%来表示，得出回收百分率。
A.3.7要求
浓度低于100μg/mL时其回收百分率应不低于80%。如果达不到要求需重新试验，试验过程中应特别注意操作技能。在测试手套样品前应验证操作员的操作技能。
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