【国家标准】 结核病病原菌实时荧光PCR检测方法

ICS 11.220
中华人民共和国国家标雅
GB/T27639—2011
结核病病原菌实时荧光PCR检测方法Real-time PCR method for the detection of tuberculosis pathogenic organisms2011-12-30发布
中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中国国家标准花管理委员会
2012-04-01实施
本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。本标准由全国动物防控标准化技术委员会（SAC/TC181)归口。GB/T27639—-2011
本标准起草单位：中华人民共和国广东出人境检验检疫局，华中农业大学、中国检验检疫科学研究院、北京盈九思科技发展有限公司。本标准主要起草人：陈茹、刘中勇、杨国海、郭爱珍、曾碧健、韩雪清、高小博、林祥梅、昊晓薇。TTKANYKAcA
1范围
结核病病原菌实时荧光PCR检测方法GB/T 27639—2011
本标规定了结核分枝杆菌复合群,结核分枝杆菌、牛分枝杆菌实时荧光PCR检测方法的技术要求和操作规范。
本标准适用于快速检测细菌塔养物、血样、奶样、痰液、组织器宫、粪便等临床样品中结核分枝杆菌复合群、结核分枝杆菌，牛分枝杆菌。2
规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T6682-2008分析实验室用水规格和试验方法GB19489—2008实验室生物安全通用要求3缩略语
下列缩略语适用于本文件。
Ct值：荧光信号量达到设定的阅值时所经历的循环数。dNTP:deoxyribonueleosidetriphosphate脱氧核书三磷酸。DMSO.dimethyl sulfoxide，二甲基亚碱。EDTA：ethylenediaminetetraaceticacid，乙二胺四乙酸。PBSphosphatebuffersolutinn，磷酸盐缓冲液。PCR：polymeranechainreaction，聚合酶链式反应。Taq：TaqDNA聚合酶。
UDG酶+uracil DNA glycosylase,尿嘧啶 DNA糖基化酶。4原理
本标推方法采用了TaqMan探针实时荧光PCR技术原理。反应体系中包括-对用于扩增DNA的引物，和--条能与PCR产物特异杂交的荧光标记探针。探针的5端标记了被称为报告基团的荧光素，3°端标记了率灭基团。在进行PCR延伸反应时，Taq酶的5外切酶活性将5\端荧光基团从探针上切割下来，使其与率灭基团分离，从而仪器能检测到5\端荧光基团所发出的荧光信号，一分子PCR护增产物的生成伴随一分子荧光信号的产生，随着扩增循环次数的增加，仪器检测到的荧光信号的累积反应了扩增产物量的变化。
本标准提供特异检測结核分枝杆菌复合群、结核分枝杆菌和牛分枝杆菌共四套实时荧光PCR检测方法（见表1)。其中，结核分枝杆菌复合群特异的实时荧光PCR方法分别以IS6110、IS1081插入基因序列为模板设计特异扩增引物与探针：结核分枝杆菌、牛分枝杆菌特异的实时荧光PCR方法分别以菌种待异的基因组序列为模板设计特异扩增引物与探针。1
TTTKAONYKACA
GB/T 27639—2011
结分技杆茜复合
群（IS6110)
结核分枝杆菌复合
群（TS1081)
结核分枝杆菌
牛分枝杆菌
衰 1荧光 PCR 引物与探针序列
核醇序列
.上游引[物:5*GCA GGG TTC GCC TAC GTG 3\下游引物 :5'CGG GTC CAG ATG GCT TGC 3'探针*:5*-FAM-TGT CAC CGA CGC CTA CGC TCG C 3*-BHQ-1上游引物:5'CCA GGA ACG CCT CAA CC 3下游引物:5*CGA CGA GGC GGA TGA TC 3”探针 :5'-FAM-AGA GGT ACG ACG CCG AAC CGA C -BHQ-I上游引物:5'CGG TGT AAT CAG TTT TGA AGC 3下游引物:5'CGA TTG GAA CGG CGA AGC 3*探针*:5'-FAM-TAG GTA GTC CAG TAG AGC CCC ATA GCC A 3*-HHQ 1上游引物:5ACG CT TCC TAA CCA GAA ITG 3下游引物,5'GGC TAT TGA CCA GCT AAG ATA TCC 3 *操针',5'-FAM-AAT TCA TAC AAG CCG TAG TCG TGC AGA A 3'- BHQ: 1，探针5\竭标记的报告荧光基团及3\端标记的率灭基团可根据荧光PCR仅设备等具体情况另行选定，5
材料与试剂
仪器与耗材
接种摔。
无菌注射器或真空采血管。
灭菌容器。
橡胶管。
甜匙。
Ⅱ级生物安全。
荧光 PCR 仪。
恒温水溶锅(室温至 100 ℃)。
离心机（最商离心力达15000×g以上）。混匀器。
冰箱(2 ℃& ℃,-20 ℃, —80 ℃>。天平(精密度达千分之一以上)。微量可调移液器（10μ,100μ，1000μ)。微量带滤芯吸嘴(10μL,100μL,1000μL)。研。
离心管。此内容来自标准下载网
PCR光学反应普。
试剂级别：除另有规定，本方法试验用水应符合GB/T6682一2008规定的二级水，所用化学试TTTKANTKACA
剂均为分析纯。
GB/T27639—2011
5.2.2引物与探针：采用无DNA酶、无RNA酶水将每条引物与操针(序列见表1)配制皮100μmol/L储存获,置一20℃或更低温度冻存;使用时取适量配制成10 μmol/L工作液，避免多欲炼融。5. 2. 3 0. 01 mol/L pH7. 6 PBS: 配方见 A. 1.5.2.4柠檬酸钠缓冲液：配方见A.2。5.2.50. 5 moL/L EDTA:配方见 A. 3,5.2.6柠機酸钠-磷酸缓冲液：配力见A.4。5.2.74为 氢氧化钠溶液:配方见 A. 5。5. 2. 84% 硫酸溶液:配方见 A. 6。5.2.9TritonX-10o。
DNA挺取液：含100mmol/L.Tris-HCl（pH8.0),0.01%TritnnX-100,200μg/μL蛋白酶K5.2.10
也可采用等效商品化试剂。
灭菌双蒸水。
三氯甲烷。
异丙醇。
5, 2. 14 无水乙醇。
70%乙醇：用新开启的火菌双蒸水配制，一20℃预冷。6荧光 PCR反应缓冲液：含 50 mmol/L KCl ，l0 mmol/L Tris-HCI（pH8.3),2.5 mmol/L5.2.16
MgC12，5%二甲基亚疯（DMSO)，5%甘油。可采用等教商品化试剂。5.2.17NTP:dATP、dUTP.dCTP 和dGTP。5. 2. 18Taq 薄,
5. 2. 19 UDG 酶
6生物安全要求
采样、样品处理皮检测过程所涉及的实验操作，应遵守 GB19489一2008的有关规定。7菜样
7.1样品采集
7.1.1细菌培养物
直接取液体培养基培养的菌液：对于在固体培养基上生长的菌落，川接种棒挑取适量（取用量达致肉眼可见,菌团大小不超过接种环)菌样,放到 0. 01 mol/L pH7,6 PBS中,振药混匀形成悬浮菌液。7. 1. 2血样
用无菌注射器或真空采血管,无菌自动物静脉采血,无菌分离血清，用无菌注射器或真空采血管，无菌自动物静脉采血，将血液直接滴入抗凝剂中，并立即连续摇动，充分混合。 抗凝剂采用柠酸钠缓冲液,或 0. 5 mol/L EDTA。每 6 mL 血液加 1 mL,抗凝剂。条件允许时，建议优先采集全血，以更有利于富集菌体。7.1.3奶样
无菌采集奶液于灭菌的容器中。一以后段奶被含菌量较多，早晟挤出的奶液含菌蛋最高。TTTKONYKAA
GB/T 27639--2011
7.1.4瘦液
动物痰液采集：动物咯痰极少，宜在消晨采集，用橡胶管自口腔伸入至气管内，外接注射器吸取痰被。亦可取咳出的痰块。人痰来集采集清晨从肺深处咳出的痰液。用灭菌容器密闭送检7. 1.5组织器富
采集动物下颌、咽后，支气管、肺（特刻是肺门及肺门琳巴结）、纵隔和肠系膜琳巴结，以及病变组织器官如肝、脾、肺等。
7.1.6粪便
采集混有粘被、血液粘膜的便，或用刮匙从动物直肠深部（约30cm)取少量粘液获便，感于灭菌容器中。
7.2样品的保存和运输
检样品在2C--8℃保存不应超过24h一20它保存不超过三个月一80℃以下长期保存。样品应置于低温、密封的容器内运输。B荧光PCR操作方法
8.1样品前处理
8. 1.1血样,细菌培养物(菌液)前处理取1mL~2mL全血样品，15000×g离心10min，弃上清；加等体积灭菌双蒸水充分振药，15000×g离心10miⅡ：弃上清，若红血球裂解不完全，带采用灭菌双蒸水重复洗涤，收集沉淀物，继续进行核酸提取，或置一20贮存备用。
取1mL~2mL血清、菌液样品，15000×g离心10min，弃上清，加1mL0.01mol/LpH7.6PBS，充分摄荡混匀，15000×g离心10min;弃.上清，收集沉淀物，继续进行核酸提取，或置一20亡贮存备用。8、T.2奶样前处理
取10mL奶液+加100μLTritonX-100，振离混勾,2500×g离心20min弃上清，取沉淀，加1mL0. 01 mo1/L pH7. 6 PBS,充分振药癌勾;将沉淀总浮液移人微量离心管,15 000×g 离心 10 min;弃上清，收集沉淀物，继续进行核酸提取，或置一20它贮存备用。8.1.3瘦液前处理
在痰液样品中加入2倍～4倍体积4%氢氧化钠溶液，振混匀，室温放胃30min，间或振荡混匀使其充分液化无期显固状物并且吸出时无拖丝现象即为液化完全：若滤化不完全，可适当再加人少量4%氢氧化钠溶腋直至液化完全>;15000×g离心10 min;弃上清,加 1 mL 0. 01 mol/L pH7. 6 PBS,充分振荡混勾，15000×g离心10min，弃上清，重复本骤1次：收集沉淀物，继续进行核酸提取，或筐一20℃贮存备用。
8.1.4组织器宫前处理
取适量织样品（剔除脂肪、被膜），剪碎，按1：5的比例加入柠酸钠-磷酸缓冲液（例如，1名组织样品+加人5mL缓冲液），充分研磨：加等量4%氢氧化钠溶液，继续研磨5min~10min，使组织液化：A
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移人离心管，充分振药，75℃温浴0.5h～1h；取上清（避免吸取粗渣），15000×g离心10min;弃上清，加等显0,01 mol/L pH7. 6 PBS,摄荡混勾,使抗谜充分悬浮,15 00×g 离心10 min,弃上满,重复本步骤1秋；收集沉淀物，继续进行钱酸提取，或置一20它贮存备用。8.1.5样前处理
敢粪样1～2按1：5的比例人4%硫酸溶液（例如1样，加5mL液体充分搬荡混匀，室温静置0.5h~1h；取上层约3mL液体<避免吸取粗渣）5000×g离心1min，取上清，15000×g离心10min;弃上清，加等量0.01mol/LFH7.6PBS，搬混勾.使沉淀充分悬浮，15000×g离心10min+弃上清，重复本步骤1次；收集沉淀物，继续进行核皎提取，或置一20它贮存备用。8.2核酸提取
在上述已完成前处理的样品（沉淀物>中如人50μL--100μLDNA提取液，充分振荡混勺，56℃温浴30 min,98它-100加热 10 min，瞬时离心使滴集管底，加等体积三氯甲烷，振满混匀，12000×g离心5min取上，直接用于PCR或忙存于--80C备用（适用于除粪样外的其他样品）。其中粪样样品还需进行以下步：如人等体积异丙醇（-20预冷），颠倒混匀，效置5mi10min;4℃，15000×g离心10min，奔上清，加3倍体积70%乙醇（4℃预冷），握洗谈，4℃，15000×z离心10 nin,弃上清,室温干燥 5 minr加入 50 μL 无 DNA 酶,无 RNA 酶水,混勾,溶解核酸,直接用于 PCR或存于80 ℃备用
可采用经验证的商品化核酸提取试剂盒。8.3荧光PCR扩增反应
8.3.1对照设立
从样品处理开始，应设置阳性对照、荫性对照。性对照：取已知阳性的同类样品作为阳性对照，也可将适盘火病原菌漆加到已知明性样品中作为阳性对照样品。
阴性对照：敢巨知阴性的同类样品作为阴性对照。空白对照：在扩塔反应阶段设置。以灭菌双蒸水作为模板设置空白对照。8.3.2扩增试剂准备
采用25μL反应体系,含以下成分：10 mmol/L Tris HCl(pH8. 3),50 mmol/LKCl ,2.5 mmol/LMgCla,0.2mmol/LdNTP1、下游引物各0.2μmol/L,探针0.1μmol/I,5%DMSO,5%甘油,0.4U尿嘧啶 DNA糖基化酶(UDG酶),1 U Tag DNA 案合酶(Taq 酶),5 μL 模板。取出荧光PCR反应缓冲液等试剂，室温融化（Taq薄，UDG酶除外）瞬时离心后置冰上，根据上述体系、按每个反应20L的用配制荧光PCR预混反随液,不足部分如灭菌双蒸水补足，需配制的荧光PCR预混反应减数量等于样品个数加上对照个数再加一。将各试剂按使用量吸取到微整离心管中，充分混勾,然后在每个PCR光学管中分装20 μL。8.3.3加模板
在已分装有荧光 PCR预混反应液的PCR光学管中每管分别加人 5 μL样品或对照的核酸模板，混匀，盖上臂盖，放人荧光PCR检测仪内+记录样品放置顺序。8.3.4费光PCR扩增反应
反应条件设定:第--阶段:50 2 min ,95 ℃ 4 in,1 个循环,第二阶段:95 ℃ 10 s,60 亡 45 s,5
GB/1 27639--2011
40个循环，荧光收集设置在60℃退火延伸时进行。荧光素设定：报告荧光Creportdye)设定为FAM(或按探针实际标记的荧光基团设定），灭荧光(quenchdye）设定为Vone，校准荧光（referencedye）设定为None。可根据不同品牌仪器说明等效设置参数。
9分析条件设定和结果判定
9.1阅值设定
综合分析仪器给出的各项结果，基线（baeline）以仪器给山的默认值作为参考，阅值（threshald设定原则以值线刚好超过正带阴性对照样品扩增曲线的最高点为准，具体还需根据仪器操声情况进行调整，选择反应所设定的荧光基团对应的通道进行分析，9.2质控
性对照和空白对照应无Ct值，阳性对照的Ct值应≤30，且呈现S型典型扩增曲线。否则，此饮实验视为无效，
9.3荧光PCR结果分析及判定
阴性反应结果判定：检测结果呈现无Ct值、无扩增曲线或反应曲线无明显对数增长期，判为荧光PCR阴性反应。
阳性反应结果判定：检测结果呈现Ct值≤35、且扩增曲线有明显的对数增长期、判为荧光PCR阳性反应。
对于35Ct值≤40的样品r，需重新取样进行重复检测。如果重复检测的Ct值<40，且曲线有明显的对数增长期，判为阳性反应。否则判为荧光PCR阴性反应。必要时，对初次检測星荧光PCR阳性反应的样品进行重友检測。10样品检测及判定
可根据需要同时进行1组～4组荧光FCR检测。建议先进行结核分技杆菌复合群IS6110、IS1081荧光PCR检测样品呈结核分技杆菌复合群IS6110和（或）IS1081荧光PCR阳性反应，均判为结核分枝杆菌复合群核酸检测阳性。
结核分枝杆菌复合群核酸检测阳性的样品，继续进行结核分枝杆菌葵光PCR反应和牛分枝杆菌荧光PCR反应以检测鉴定感染的菌种；检测反应呈阳性的对应判为结核分技杆菌核酸检测阳性或牛分枝杆菌核酸检测阻性。
11注意事项
检测过程防止交受污染应注意的事项见附录B。6
A.t0. 01 mol/L pH7.6 PBS
先配制A液、B液。
附录A
（规范性附录）
试剂的配制
GB/T 27639—-2011
A液(0.2mol/LNaH,PO,溶液).称取一水合磷酸二氢钠A.2柠橄酸钠缓冲液
柠檬酸(C.H.OH.0)
柠檬酸钠(Na;C,H.OtH,)
葡萄糖(CH1z O。H,0)
称取上述试剂，榕解丁蒸水，定容至1L混匀。采用（121士2）℃/0，1MPa.15min高压灭菌后存于4℃。
A.3D.5 moI/L EDTA称取186.t区EDTA，加人80UmL蒸馏水中，磁力搅拌器上剧烈搅拌，用氢氧化钠（NaOH)pH至8.U,定容至 1 I,分装，来用(121士2）/D,1MFa,15 min高压灭菌后贮存于室温。A. 4柠檬酸钠-磷酸缓冲波液
先配制 pH6.8磷酸缓冲液。
A羧(0.2 moI/L磷酸二氢钠溶液):称取磷酸二氢钠(NaH,PO,.2H,0)15. 61 多,加双蒸水溶解，定容至500ml。
B液(0.2ol/L磷酸氢二钠溶液>:称取磷酸氢二钠(Na2HPO,12H.O)35.82g.加双蒸水溶解，定容至500㎡L。
分别量取51mLA液,49mLB液，混合即成100mLpH6.8磷酸缓冲液。称取 2.84g柠檬酸钠(Na;C,HQ·2Hz0),加人100mLpH6.8磷酸缓冲减中,充分溶解。采用(121士2)\C/0. 1 MPa,15 min 商压灭菌后贮存于 4 。7
GB/T27639--2011
A.54%氢氧化钠溶液
称取8多氢氧化钠，加入200nI双悉水中，充分裕解。温贮存。A,64%硫酸溶液
量取20mL浓硫酸，加入500mL双水中，混匀，室温贮存。附录B
（规范性附录）
检测过程防止交受污染的措施
GB/T 276392011
B.1采样及样品处理过程，成防止不同样品之间通过器具，于套等的交叉污染。来样改样品处理工具应经过高压灭菌或高温烘烤处理，一套工具仅限一个样品使用。存放样品的容器应清洗，高压灭菌或高温烘烤处理，或使用一次性灭菌容器，B.2实验过程，应穿工作服和戴一次性手套，勤换手套，工作服应经常清洗。B.3使用带滤芯吸嘴。吸嘴、离心管、PCR管等应经过商压灭菌处理，次性使用，不得回收清洗后重复使用。
B.4样品处理与PCR加样应在不同的区域进行，不同区域配备独立的加伴工具和用具。该区域可以是独立的空间间隔、有紫外消毒设施的独立的设备如核酸提取工作站、PCR加样工作站，可密闭进行紫外消声的超净工作台、生物安全柜等。若在散开的空间逃行核酸提取或PCR加样，该空间应安装紫外灯或配备具有等同降解核酸功能的设备如移动紫外灯、带紫外消毒功能的空气消毒净化器等。上述区域在每次使用后应及时清洁处理，并在使用前后照射紫外30min以上。每个区域应有专门的废弃物容器，该容器应能耐受煮沸、10%次氯酸钠溶液消毒处理。每次实验结束，应在紫外消毒前，及时清理废弃物及消毒容器，并将该废物容器放回工作区进行紫外消毒，B.5PCR反应等试剂应按检测需求分装贮存，避免同-一管试剂率饮开启使用。B6装有核酸模板、样品或试剂的离心普在打开之前，应短书离心，避免离心管崩开，所有操作尽革避免产生气溶胶。
B.7上机运行前，应检查盖紧PCR管，以防炭光物质或模板泄漏面污染机器。B.召应遵循基因检谢实验室其他技术要求。9
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