【国家标准】 副结核分枝杆菌实时荧光PCR检测方法

ICS 11.220
中华人民共和国国家标准
GB/T 276372011
副结核分枝杆菌实时荧光PCR检测方法Real-time PCR method for the detection ofMycobacterium avium subsp. paratuberculosis2011-12-30 发布
中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中国国家标准化管理委员会
2012-04-01实施
本标准按照GB/T1.1--2009给出的规则起草。本标准由全国动物防疫标准化技术委员会(SAC/TC181)归口。GB/T27637—2011
本标准起草单位：中华人民共和国广东出入境检验检疫局、吉林农业大学、北京盈九思科技发展有限公司。
本标准主要起草人：刘中勇、陈茹、杨国海、高云航，曾健，朱道中、吴晓薇、商小博。TTKANYKACA
1范围
副结核分枝杆菌实时荧光PCR检测方法GB/T 27637—2011
本标推规定了副结核分枝杆菌（Mycobacteriumaium stubsp.paratubercutosis）实时荧光PCR检测方法的技术要求和操作规范，本标推适用于快速检测培养物.血样、奶样、粪便和组织等临床样品中副结核分枝杆菌。2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是痒日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T6682—2008分析实验室用水规格和试验方法GB19489—2008实验室生物安全通用要求3缩略语
下列缩略语适用于本文件。
Ct值：荧光信号量达到设定的解值时所经所的循环数。dNTP：deoxyribonucleosidetriphosphate脱氧核苷三磷酸。DMSO:dimethyl sulfoxide，二甲基亚砜EDTA:ethyleae diaminetetraacctic acid,Z二胺凹Z酸PBS:phosphate buffer solution,磷酸盐缓冲液PCRpolymerasechain reactian，聚合酶链式反应。Taq 酶:Taq DNA 案合酶,
UDG 酶:ulacil DNA glycosylase,尿噻啶 DNA 糖基化酶。4原理
本标准方法采用了TaqMan探针实时荧光PCR技术原理。反应体系中包括一对用于扩增DNA的乳物，和一条能与PCR产物特异杂交的费光标记探针。探操针的5端标记了被称为报告基团的荧光素,3*端标记了萍灭基团。在进行PCR延伸反应时,Taq酶的5*外切酶活性将5端荧光基团从探针上切割下来,使其与率灭基团分离，从而仪器能检测到5*端荧光基团所发出的荧光信号，-分子PCR扩增产物的生成伴随一分子荧光信号的产生。随着扩增循环欣数的增加，仪器检测到的荧光信号的暴积反应了扩增产物整的变化。本标准方法以副结核分枝杆菌特异的F57基因序列为模板,设计特异增引物和探针建立荧光PCR反应体系。5材料与试剂
5.1位器与耗材
5. 1. 1 接种棒。
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GB/T 27637—2011
无菌注射器或真空采而管。
灭菌容器。
橡胶管，
刮匙。
荧光 PCR 仪。
桓温水浴锅(温至 100 )。
离心机（最高离心力达15000×g以上）。5. 1. 9
混勾器。
5. 1. 10 冰箱(2 ~8 ,-20 ,-80 ℃) 5. 1. 11
天乎（精密度达千分之一以上）。微量可调移液幕（10μ100μ1000μ）。5, 1. 13
微量带滤芯吸嘴（10μ100μ,1000μ）。5. 1. 14 研钵。
5. 1. 15 离心管。
5.1.16PCR光学反应警。
5.2试溯
5.2.1试剂级别：除另有规定，本方法试验用水应符合GB/T6682·-2008规定的二级水.所用化学试剂均为分析纯：
5.2.2引物与探针：采用无DNA酶、无RNA酶水将每条引物与探针配制成100μmol/L.储存液，置-·20亡或更低温度冻存；使用时取适量配制成10μmol/L工作液，避免多次冻融。上游引物：5*GTCAGCGGCGGTCCAG 3*,下游引物：5*GCAGCTCCAGATCGTCATTC 3”，操针：5*-FAM-ACGAGCACGCAGGCATTCCAAGTC3'-BHQ-1.5.2.3 0.01 mol/L pH7.6 PBS:配方见 A,1.5.2. 4柠檬酸钠缓冲液:配方见 A, 2,5.2.50,5mol/LEDTA:配方见A.3。5.2.6柠檬酸钠-磷酸缓冲液；配方见A.4。5.2.74%氢氧化钠溶液：配方见A.5。5.2.8 4% 蔬溶液,配方见 A. 6。5.2.9 Triton X-100.
5. 2. 10 DNA 提取液:含 100 rmrnol/L Tris-HCl (pH8, 0),0. 01% Triton X-100,200 μg/μL 蛋白酶 K,也可采用等效商品化试剂。
5.2.11灭菌双蒸水。
三氧甲烷。
异丙醇。
无水乙醇，
5.2.1570%乙醇：用新开肩的灭菌双蒸水配制，20℃预冷。5.2.16
荧光 PCR 反应缓冲液:含 50 mmol/L KCl, 10 mmol/L Tris-HCl (pH8. 3),2. 5 nmol/IMgCl，5%二甲基亚虱（DMSO)，5%甘油。可采用等效商品化试剂。5.2.17dNTP:dATP、dUTP.dCTP和dGTP。5.2. 18
Taq。
5. 2. 19 UDG 酶.bZxz.net
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6生物安全要求
GB/T27637—2011
来样，样品处理及检测过程所涉及的实验操作，应避守GB19189一2008的有关规定。7采样
7.1样品采年
7.1.1培养
直接取液体培养基培养的菌液：对于在固体培养基上生长的菌落，用接种梓挑敢适量（取用量达到内眼可见，菌团大小不超过接种环>菌样，放到0.01mol/LPH7.6PBS中，振瑟混匀形成悬浮菌被。7. 1. 2 血样
用无菌往射器或真空采血管，无菌自动懒静脉采血，无菌分离血清。用无菌注射器或真空来血管，无菌自动物静脉采血，将血液直接滴入抗凝剂中，并立即连续摇动，充分混合。抗凝剂采用檬酸钠缓冲被,或 0. 5 mol/L FDTA。 每 6 mL 班液加 1 naL 抗凝剂,条件充许时，建议优死采集全血，以更有利于富集菌体。7.1.3奶样
无菌采集奶液于灭菌的容馨中。一般以后段奶腋含菌较多，早层拼出的奶被含菌量较高。7. 1.4 获使
取新鲜粪便，选取题满粪便或混有粘液，血液，粘膜的粪便，或用刮匙从动物直题深部（30cm）取少蛋粘液便，感于灭菌容器中。7. 1.5 组织
选取有明显病变的肠段、回盲瓣以及病肠相邻部位的淋巴结7.2样品的保存和运输
待检样品在2它～8℃保存不应超过24h一20C保存不超过三个月一80它以下长期保存。样品应置于低温，密封的容器内运输。B操作方法
8. 1 样品前处理
8. 1. 1血样,培葬物(菌液)前处理敢1mL2mL全血样品，15000×g离心10mi，弃上清：加等体积灭菌双蒸水充分振满，15000×g离心10min；弃上清，著红血球裂解不完全，需采用灭菌双蒸水重复洗涤，收集沉淀物，维续进行核酸提敢，或置一20亡贮存备用。取 1 mL~2 mL 血清,菌液样品+15 000× g 离心 10 min,弃.L清:加 1 mL 0. 01 mol/L pH7. 6 PBS,充分振药混匀，15000×g离心10min;弃上清，收集沉淀物，继续进行核酸提取，或置一20℃备用。3
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GB/T 27637—2011
8.1.2奶样前处理
取10mL奶液，加100l.TritonX-100.振混勾，2500×g离心20min，弃上清，取沉淀，加1ml0.01nol/LpH7.6PBS，充分振混匀，将沉淀悬浮液移人微量离心管，15000×g离心10min弃.上清，收集沉淀物，继续进行核酸提取，或置一20℃贮存备用。8.1.3粪样前处理
取粪样1g~～2g，按1+5的比例加人4%硫酸溶液（例如1ε粪样，加5n液休）充分摄荡混勺，室温静置0.5h--1h;取[F-层药 3mL液体(避免吸取粗渣）5000×g离心1 min,取上清，15000×g离心10min；弃上清，加等量0.01mo1/LpH7.6PBS，振酱混勾.使沉淀充分悬浮，15000×g离心10min；弃上消，重复本步骤1次收集沉淀物，维续进行核酸提取，或置一20℃贮存备用。8.1.4组织样品前处理
取适量组织样品（剔除脂肪、被膜）剪碎,按1：5的比例加人柠檬酸钠-酸缓冲液（例如,1 g组织样品，加人5mL缓冲液），充分研磨：加等量4%氢氧化钠溶液，继续研磨5min～10min，使组织液化，充分振荡,75 芒温浴 0.5 h ~1 h,取上清(避免吸取粗道),15 000×≤离心10 mi;弃上清,加等星0.01mol/LPH7.6PBS，振荡混勾，使沉淀充分悬浮，15000×g离心10min，弃上清，重复本步骤1次；收集沉淀物，继续进行核酸提取，或置一20C贮存备用。8.2核酸提取
在上述已完成前处理的样品（淀物）中加人50μL～100μLLVA提取液，充分振荡混匀，56℃温浴 30 min,98 亡 ～100 ℃加热 10 min,瞬时离心使液滴聚集管底,如等体积三氧甲烷,振药混勾,12000×g离心5min,取上清，直接用于PCR或贮存于--80它备用（适用于除样外的其他样品）。粪样样品还需进行以下步骤;加人等体积异丙醇(一20℃预冷）,颠倒混句,放置 5 min~～10 min;1 ℃,15000×g离心10min，弃上清，加3倍体积70%乙醇（4℃预冷），振菌洗涤?4℃，15000×g心10min，弃上清，室温干燥5min加入50μL无DNA酶、无RNA酶水混勾、溶解核酸，直接用于PCR或忙存于一80℃备用。
可采用经验证的商品化核酸提取试剂盒。8.3扩增反应
8.3. 1 对照设立
从样品处理开始，应设臂阳性对照，阴性对照。阳性对照：取已知阳性的同类样品作为阳性对照，也可将适量灭活的病原菌添加到已知阴性样品中作为阳性对照样品。
阴性对照，取已知阴性的同类样品作为阴性对照。空白对照：在扩增反应阶段设置。以灭菌双蒸水作为模板设置空白对点。B.3.2扩增试剂准备
采用25μL反应体系，含以下成分:10 mmol/L Trix-HCl(pH8.3),50 mmol/L KCl,2.5 mmol/lMgCl2,0. 2 mmol/L dNTP,上、下游引物各0.2 μmo1/L,探针 0. 1 μmol/L,5% DMSO,5%甘油,0. 4 UUDG 酶,1U TaQ 酶,5 μL 核酸模板。取出荧光PCR反应缓冲液等试剂,室温慰化(Taq酶,ULG酶除外),解时离心后置冰上，根据上述TTTKAONYKACA
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反应体系，按每个反应20L的用量配制荧光PCR而混友应液，不足部分加灭菌双获水补足：需配制的荧光PCR预混反成液数量一样品个数十对照个数十1。将各试剂按使用量吸取到微量离心管中，充分混勾，然后在每个PCR光学管中分装20μL，8. 3. 3加样
在已分装有荧光FCR预混反应液的PCR光学臂中每管分别加入5uL样品或对照的核酸模板，症勾，盖上管盖,放入荧光PCR仪，记录样品放置顺序。8.3.4荧光PCR扩增检测
反应条件设定:第一阶段:50 ℃ 2 min,95 ℃ 4 min,1 个循环,第二阶段:95 ℃ 10 s,60 ℃ 45 s,40 个循环，60℃时设置采集荧光。
荧光素改定：报告荧光（reportdye)设定为FAM（或按探针实际标记的荧光基团设定），率灭荧光(quenchdye）设定为None，校准荧光(rcferencedye)设定为None。可根据不同品牌仪器说明等效设置参数。
9分析条件设定和结果判定
9, 1网值设定
综合分析仪器给出的各项结果，基线（bseline）以仪馨给出的默认值作为参考，阅值（threshold)设定原则以阅值线刚好超过正常阴性对照样品扩增曲线的最商点为准，具体还需根据仪器噪声情况进行调整，选择反应所设定的荧光基团对应的通道进行分析9.2质控
阴性对照和空白对照应无Ct值，阳性对照的Ct值应≤30，且呈现S型典型扩增曲线。否厕，此次实验视为无效。
9.3结果分析及判定
在质控有效的条件下进行结果判定。阴性反应结果判定：检测结果呈现无t值、无扩增逝线或反应曲线无明显对数增长期，判为荧光PCR阴性反应，样品判为副结核分枝杆菌核酸检测阴性。阳性反应结果判定：检溯结果呈现Ct值≤35、且扩增曲线有明显的对数增长期，判为荧光PCR阳性反应,样品判为副结核分枝杆菌核酸检测阳性。对于35检测过程防止交叉污染应注意的事项见附录B，GB/T27637—2011
A 10. 01 mol/L pH7.6 PES
先配制 A 液,B液,
附录A
(规范性附录）
试剂的配制
A液(0.2mol/LNaH,PO,溶液）：称取一水合磷二氢钠（NaHPO·H.)27.6g或二水合磷酸二驾钠(NaH.PO,·2HO)31.2g，溶于蒸馏水申,定容至1L。R液（0.2mol/LNa.HPO。溶液）：称取十二水合磷酸氢二钠(Na:HPO。-12H:O)71.6g,或二水合磷酸氢二钠(NazHPQ,·2HtO)35.6,溶于蒸缩水中,定容至1L。称取17氯化钠，用适量蒸馏水溶解，量取13mI.A液和87mLB液，混合，用蒸馏水定容至2L。采用(121士2)C/0.1MPa,15 min高压灭菌后贮存于4 亡。A.2柠檬酸钠缓冲液
柠酸(C.HO,·H,O)
柠檬酸钠(Na:CsH,O·H2O)
葡药糖(CgHiz。·H,0)
称取上述试剂，溶解于蒸馏水.定容至1L，混勺。采用121C二2C/0.1MPe，15min高压灭菌后存于 1℃。
A.30.5 mol/L EDTA(pH8.0)
称取186.1gEDTA，加入800mL蒸馏水中，磁力搅拌器上剧烈搅拌，用氢氧化钠NaH）调pH至8.0,定容至1L，分装，采用(121士2)℃/0.1MPa，15min高压灭菌后贮存于室温。A,4柠檬酸钠-磷酸缓冲液
先配制PH6.8磷酸缓冲液。
A液(0.2mol/L磷酸二氢钠溶液）：称取磷酸二氢钠（NaH.PO。2H,0)15.61g，加双蒸水溶解，容至 500 mL。
B液（0.2mol/L磷酸氢二钠溶液）：称取磷酸氢二钠(NazHPO·12H.O)35.82g加双蒸水溶解，定容至 500mL
分别盘取51 mLA被49mLB液,混合即成100mLpH6.8磷酸缓冲液。称取2.84多柠檬酸钠(Na:C,H.0-2H.0),加人100mLPH6.8磷酸缓冲液中,充分溶解。采用(121±2)/0.1MPa，15min高压灭菌后吧存于4℃。A.54%氟氧化钠溶液
称敢8区氢氧化钠.加人200mL双蒸水巾，充分游解。室温贮存。6
4%硫酸溶液
量取 20 mL 浓疏酸,加人 500 mL 双蒸水中,混匀。 室温些存。CB/T27637—2011
GB/T27637-2011
附录B
（规范性附录）
检测过程防止交叉污染的措施
B.1采样及样品处理过程，应防止不同样品之间通过器具，手套等的交艾污染。采样及样品处理工具应经过高压灭菌或高温烘烤处理，-套工具仅限一个样品使用。存放样品的容器应清洗、高压灭菌或高温姚烤处理，或使用一次性灭菌容器。B.2实验过程,应穿工作服和戴一次性手套,翻换手套，工作服应经常清洗。B.3使用带滤芯吸嘴。吸嘴、离心管、PCR管等应一次性使用，不得回收清洗后重复使用。B.4样品处理与CR斥样应在不同的区域进行，不同区域配备独立的加样下具和用具。该区域可以是独立的空闻间隔，有紫外消毒设施的独立的设备如核酸提工作站,PCR加样工作站,可密闭进行紫外消毒的超净工作台，生物安全柜等。若在散开的空间进行核酸提取或PCR加样，该空间应安装紫外灯或配备具有等间降解核酸劲能的设备如移动紧外灯，蒂紫外消毒功能的空气毒筝化器等。上述区撼在每欢使用后应及时清活处理，并在使用前后射素外m以。每个区域应有专门的废弃物穿器，该容器应能耐受煮沸、10%次氯酸钠溶液消毒处理。每次实验结束，应在紫外消毒前，及时清理废弃物及消毒容器，并将该废弃物容器放回工作区进行紫外消毒，B.5PCR反应试剂应按检测需求分装贮存，避免同一管试剂多饮开启使用。B,6装有核酸模板,样品或试剂的离心管在打开之前，应短暂离心，避免离心管崩开，所有操作尽量避免产生气溶胶。
B.7上机运行前,应检查非盖紧各PCR管，以防荧光物质或模板泄漏而污染机器。B.8应遵循基因检测实验室其他技术要求。
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