【国家标准】 马鼻肺炎病毒PCR检测方法

ICS 11.220
中华人民共和国国家标准bZxz.net
GB/T27621—2011
马鼻肺炎病毒PCR检测方法
Protocol of PCR for egaine rhinopneumonitis virus2011-12-30发布
中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中国国家标准化管理委员会
2012-04-01实施
本标准铵照 GB/T 1. 1—2009 给出的规则起草。本标摧由中华人民共和国农业部提出。本标准由全国动物防疫标准化技术委员会（SAC/TC181)归口。本标准起草单位：新疆农业大学。本标谁主要起草人：冉多良、单文鲁、马伟、王传锋、张伟。TTKAONKACA
GB/T27621—2011
1范围
马罩肺炎病毒PCR检测方法
本标雄规定了马鼻肺炎病毒的 PCR梳测方法。GB/T 27621—2011
本标准适用于马匹的流通和进出境检接实施马案肺炎的现场检疫和后续监管工作。一步法PCR险测技术适用于实验室细胞囊样品检测：染式PCR检测技术适用于临床疑似样品及细胞毒样品检测。2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注目期的引用文件，仅注甘期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的惨改单)适用上本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法3缩略语
下列缩略语适用于本文件。
FHV,cquinerhinopneumanitis，马传染性鼻肺炎。RNA：ribonuclcicacid,核糖核酸。CPE:cytopa1hic effect,细胞病变。EB:ethidium bromide,漠化乙锭。EDTA;ethylene diaminetetraacetic acid,乙二胺西乙酸SDS;sodiurn dodecyl sulfate，十二烷基磺酸钠。BHK-2l:babyhamsterkidneycell,仓鼠幼肾细胞。PBS:phosphatc buffer sodium.群酸盐缓冲液。4试剂和材料（试剂不经注明，均为分析纯）4. 1水：符合 GB/T 6682中一级水的规格。4.2RNA酶A.
酸-三氟甲烷，
2%琼脂糖凝胶;见 A.1。
浪化乙统(10 μg/μI.)t见 A,2,4.6
DNA 巯合酶(5 U/μL)。
50XTAE电泳缓冲液(pH8.5)：见A.3。4.75
10XPCR Buffer (plus Mg-).
2. 5 mmol/mL dNTP.
蛋白酶 K(20 mg/ml)。
BHK-21 细胞。
含2%接牛血清的MEM维持液。
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GB/T 27621—2011
4.130.3mol/LZ酸钠
4. 14 0. 01 mal/L PBS 缓冲液(pH 7. 2):见 A. 4。4. 15 SDS.
s10XTE缓种液pH8.0).见A.5。
4.17无水乙醇。
70为乙醇。
Tris饱和盼(pH8.0)
分子质量标准DL2000。
5器材和设备
5.1低温冷练高速离心机：
5.2倒置显微镜。
5.3CO.恒温培养箱。
5.4普通冰箱和超低温冰箱。
5.5组织研磨器。
5. 6 1. 5 tL离心管。
5.7PCR扩增仪。
5.8水平电泳槽。
5.9微量移液器及吸义。
5.10紫外照射仪或疑胶成像仪。6EHV 的分离
6.1来样
取马流产胎儿病料的肺,脾或淋巴组织，疑似病驹呼吸系统的鼻咽拭子3根。6.2样品处理
组织样品2g与2mL0.01mol/LPBS缓冲液置于组织研磨器中研磨匀浆，反复冻融3次：鼻咽拭子 3 根在 2 mL 0. 01 mol/L PBS缓冲液中洗脱,反复冻醚 3 次，离心取上清。6. 3病毒增殖
将毒种接种到单层的BHK-21细胞上，37℃吸附1h,加适量含2%的较牛血清的MEM维持液，CO，恒温培养箱37C静置培养，利用倒置显微镜逐日观察CPE，48h后当CPE达85%以上时收毒，冻存于一70 它冰箱备用。
7EHV的PCR检测
7. 1样品处理
组织样品2g与2mL0.01mal/LPBS缓冲液研磨勾浆.反复冻融3次；鼻咽拭子3根在2mL0.01mo1/LPBS缓冲液中洗脱，反复冻融3次，离心取上清。2
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7.2核酸抽提
GB/T27621—2011
取适当病料或细胞毒 0. 5 mL,加人 RNA酶 A 至终度为 100 μg/mL,37 C作用 30 min;加人20mg/mL 蛋白酶K至终浓度为 100 μg/mL,SDS终度为 0. 5%。在 56 水浴内反应 60 min至反应物清亮，期间不断轻摇溶液。加等体积 TE饱和酚,轻摇 20 min,12 000 t/min 离心 7 min;取水相加等体积酚-三氯甲烷(1 ！ 1),轻摇 20 min,12 (00 r/min 离心 7 min;取水相加等体积兰氯甲烷,轻摇15 min,12 000 r/min离心7 min;收集水相，在上述水相中加人2. 5倍体积预冷的无水乙醇和终浓度为0.3mol/L乙酸钢，—20℃放置20min。12000r/min离心10min，使核酸沉淀，弃去上清液。立刻加人70%乙醇，将沉凝漂洗2次，以去除残留的盐类。倾去乙醇，倒置在滤纸上干燥，然后加 0,5切LTE(pH 8. 0),于 4 ℃冰箱内过夜溶解 DNA。37 ℃于燥 20 min 或抽真空干燥:最后加 10 μL 水溶解后,作为 PCR模板。
7. 3以引物 F、引物 F1c 和引物 F4c(参见 B, 1)为条件的体系含 1. 5 mmol/I. MgCl的 10XPCR Buffer 5 μL;2. 5 mol/L 的 dNTP 4 μL引物 F,引物 F1c 和引物 F4c(参见 B, 1)各 1 μL;模板 DNA 1 μL;DNA 案合酶 D. 5 μL;加双获水至 50 μL,然后将 上述成分混合均句。在PCR扩增仪上进行扩增，PCR放应条件为94C预变性4min，30次如下循坏：941min,56℃1min，72℃1min，最后?2延伸7min.取10LPCR扩增产物+加2 μL 6×加样缓冲液,在含有激化乙锭的 2为琼脂糖凝胶上电泳30min在紫外照射仪或疑胶成像仪上观察产物荧光带位置，以DNA2000Markcr作分子质量标准比较:EHV-1会山现311 bp的DNA片段,EHV.4会出现 468 bp的DNA片段。空凹对照在311bp和468bp没有核酸带（参见附录C)
7.4巢式 PCR扩增方法
7.4.1以引物Fz和引物Fc[参见B.2a)为条件的体系如下：-. 含 1. 5 mmol/I, Mg Cl,的 10XPCR Buffer 5 μL;2. 5 mmol/L 的 dNTP 4 μL,引物 Fz 和引物Fc[参见 B, 2a)_各 1 μL;模板 DNA 1 μL;2. 5U DNA 案合酶 0. 5 μL;加双蒸水至 50 μL,混合均匀·瞬时离心后，敢人PCR仪中。PCR反应程序为94它预变性4min,25次循环（94它变性1min,51它退火1min,72℃延伸1min，最后72℃延伸7min），取出PCR反应产物一取10μLPCR扩增产物，加2μL6×加样缓冲液，在含有溴化乙锭的2%琼脂糖凝胶上电泳30min，在紫外照射仪或凝胶成像仪上观察产物荧光带位置，以DNA2000Marker作分子质量标准比较（标准EHV-1和EHV-4会出现747bp的DNA片段，空白对照在747bp没有DNA片段,参见图 D.1)。
7, 4. 2巢式 PCR第二次反应:待扩增病毒 DNA 为 100 倍稀释的一次扩增 PCR 产物作为二次扩增模板。 以引物 F1 和引物 F1cL参免 B. 2b)为条件的体系如下:含 1. 5 mmol/L MgCl的 1o×PCRBuffer5μL2,5mmol/L的 dNTP 4 μL;物 F1 和引物F1c[参见 B, 2b)]各 1 μL;模板 DNA 1 μL:2. 5U DNA 桑合酶 0. 5 μL;加双蒸水至 50 μL。然后,将以上各成分混合均匀放入PCR仪中。PCR反应条件为 94C预变性4min，25次循环(94℃变性 1 min,45 ℃退火 1 min,72 ℃延伸 1 min,最后 72 ℃延伸7 min);一：取 10 μL FCR扩增产物,加 2 μL 6 ×加样缓冲糖,在含有浪化乙疑的 2%琼脂糖凝胶上电泳30 min,在紫外照射仪或凝胶成像仪上观察产物荧光带位置,以DNA 2000 Markcr作分子质量标准比较（标准EHV-1出现404bp的DNA片段，空白对照在404bp没有DNA片段，参见图 D,2).
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7.4,3以「物F4和引物F4cL参见B.2c)为条仆的体系如下：—含1.5mmol/LMgCla的10×PCRBuffer5μL;2.5mmol/I.的dNTP 4μL,引物F4和引物F4c参B.2c)各1μL模板DNA1μL：2.5UDNA聚合酶0.5μL;加双蒸水至50μL.然后将以上各成分混合均匀放人PCR仪中。PCR反应程序为94C预变性4min.25饮循环(94 ℃ 变性 1 in,56 ℃退火 1 min,72 C延伸 1 min,最后 72 延伸 7 min)i取10μLPCR扩增产物，加2μL6×加样缓冲液，在含有漠化乙的2%琼脂糖凝胶上电泳30min，在外照射仪或凝胶成像仪上观察产物荧光带位置，以DNA2000Marker作分子质量标准比较(标准 EHV-1 出现 334 bp 的 DNA 片段,空白对照在 334 bp 没有 DNA 片段,参见图 D. 3)
7.4.4以引物F和引物Fl、F4c参见B.2d>)]为条件的体系如下：含1.5mmol/LMgCl的10×PCRBufler5μL，2.5mmol/L的dNTP4μl.;引物F.物FIc和引物F4cL参见B.2d_各1μL模板DNA1μL;2.5UDNA案合酶0.5μL;加双蒸水至50μL，然后将以上各成分混合均匀放人PCR仪中。反应程序为91预变性4 mih,25次循坏(94 变性 1 min,50 ℃退火 1 min,72 它延伸 1 min最后72 延伸 7 min)：—取10μLPCR扩增产物，加2μL6×加样缓冲液，在含有祺化乙锭的2%琼脂糖瘦胶上电泳30rnin，在繁外照射仪或胶成像仪上观察产物荧光带位置，以DNA2000MarkeI作分子质基标准比较（在311bP位置上有核酸带，判定为EHV-1型阳性样品：在468bp位置上有核酸带，判定为EHV-4型阳性样品；在311bp和468bp位置上有核酸带，可判为EHV-1和EHV-4型混合感染，参见图D.4)。7.5设立对照
7.5.1在7.1中的样品处理过程中必须设立阳性样品对照.阴性样品对照,空白对照。7.5.2联含有知EHV的病毒标准株的组织悬液作为阳性对照。7.5.3采用未接种病毒的正常BHK-21 细胞抽提核酸作为阴性对照。7,5.4取等体的水代替模板作为空白对照。7.6琼脂糖电泳
用TAE电泳缓冲液配制2%的琼脂糖（含1μ品/mLEB）平板。将平板放人水平电泳，使电泳缓冲液刚好滤没胶面。将6μL.PCR扩增产物和2μL漠蓝指示剂溶液混勾后加人升内。在电泳时使用核酸分子质量标准参照物作对照。5V/cm电泳约0.5h，当溴龄兰到达琼脂糖凝胶的底部时停止。7.7结果判定
7.7. 1一步法 PCR 扩增结果判定如下(以 DNA 2000 Marker 作分子质量标推比较):a）EHV-1会出现311bp的DNA片段，EHV-4会出现468bp的DNA片段，空白对照在311bp和468bp没有核酸带。对照成立才能进行判定。在311bp位置上有核酸带，判定为EHV-1型阳性样品若在311bp位置上无核酸带，判定为b)
EHV-1型阴性样品。在468bp位置上有核酸带，判定为EHV-4阳性样品，若在468bp位置上无核酸带，判定为EHV-4型阴性样品。7.7.2巢式PCR结果判定如下（以DNA2000Marker作分子质量标准比较）：a）--次PCR扩增结果：标准EHV-1/4会出现747bp的DNA片段。空白对照在747bp没有DNA片段。二次PCR扩增结果：标准EHV-1出现311bp或404bp的DNA片段。空白对照在311bp或404bp没有DNA片段。标准EHV-4出现334bp或468bp的DNA片段：空白对照在334bp或468bp没有DNA片段。两次结果对照成立才能进行判定。4
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）若一次扩增后在747bp位置上有核酸带，判定为阳性样品：无核酸带或条带的大小不在b
747bp位置上，判为阴性样品。若二次扩增后在311bp或404bp位置上有核酸带，判为EHV-1 型阳性样品;无核酸带或条带的大小不在 311 bp 或 404 bp 位置上,判定为非 EHV-1型阳性样品。若二次扩增后在331bp或468bp位置上有核酸带，判为EHV-4型阳性样品：无核酸带或条带火小不在334bp或468bp位置上，判为非EHV-4型阳性样品。若二次扩增后在311bp和468bp位置上有两条核酸带，可判为EHIV-1/4型混合感染。GB/T 27621--2011
A. 12归琼脂糖凝胶
1XTAE电泳缓冲液
附录A
（规范性附录）
试剂的配制
100 mL
微波炉中完全融化，待冷至50℃时，加漠化乙锭(EB)溶液5μL，摇匀，倒人电泳板上，凝固后取下梳子，备用。
2澳化乙锭（EB)溶液（10 mg/mL）A.2
溴化乙链
灭潮双燕水
100 mL
A.350×TAE电冰缓冲准(pH8.5)
羟基甲基氨基甲烷(Tris）
EDTA-2H,0
冰乙酸
灭菌双蒸水加至1000mL，用时用灭菌双蒸水稀释使用。A.40.01 mol/LPBS缓冲液(pH7.2)Nag HPO.
灭菌效蒸水加至1000 mL+简压灭菌。A. 510 × TE缓冲液
1mol/Ltris-HClBuffer
0,5 mol/L EDTA(pH 8, 0)
100 raL
灭菌双蒸水加至1 000 mL，高压灭菌。6
B, 1一步法 PCR 引物
附录B
(资料性附录）
引物序列及其特性
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引物台成参照GencBank中的EHV-1和EHV-4的部分gB基因序列，用Primerpremier5.0软件设计特异性引物，其浓度为10Fmol/mL，序列如下：F
5*GATGCCATGGAGGCACTACAC3*
F1c:5'CTCGACTTTCTTCTCTCGGTCC3*F4c:5'TTGACACACAGTCGGTGAGT3\B. 2 巢氏 PCR 引物
EHV-1和EHV-4共有
EHV-1特有
EHV-4 特有
引物合成参照GeneBank中的EHV-1和EHV-4的部分gB基因序列，用Prinerprcmier5.0软件设让特性引物其薇度为10opmol/mL，序列如下：2）巢式PCR第一次反应的引物
5'GGAAAGGATAEAGCCATACGTC3
5'GTATATCGAGTCTATGGCTTC3*
巢式PCR第二欲反应扩增EHV-1的引F1:5'GAGGTGGAGCTTGATTTGTG3\F1c:5'CTCGACTTTCTTCTCCGGTCC3c）巢式PCR第次反应扩增FHV-4的引物F4:5'TCGGTCAGCTGCICAGTTAG3*
F4C:5'TTGACACACAGTCGGTGAGT3
巢式PCR第二饮反应间时扩增EHV-1和EHV-4的引物F
5'GATGCCATGGAGGCACTACAC3'
5ETCGACTTTCTTCTCTCGGTCC3
F4C,5TTGACACACAGTEGGTGAGT3
EHV-1 和 EHV-4 共有
EHV-1和EHV-4共有
EHV-1特有
EHV-1特有
EHV-4特有
EHV- 持有
EHV-1和EHV-4共有
EHV-1特有
EHV-4特有
GB/T27621-—2011
M——DNAMarker(DL2000);
附录C
（资料性附录）
一步法PCR反应结果
标准EHVI和标准EHV4混合DNA，
2——朗性对照；
3—标准EHV-IDNA
4——标准EHV-1DNA。
以F/F1c-F4c为引物的一步法 PCR 反应结果M-—DNA Marker(DL 2000):
标准EHV1DNA
2——标准EHV-4 DNA;
3-—医性对。
-DNAMarker(DL20oo):
1——标准EHV-1DNA
-标准 EHV-4 DNA;
阴性对照。
附录D
（资料性附录）
巢式法PCR反应结果
以Fz/Fc为引物的第一次PCR反应结果M
图D.2以F1/F1c为引物的套式PCR反应结果GB/T27621—2011
GB/T27621—2011
M-DNA Merker(DL 2000);
1标准EHV-4DNA：
2——标准EHV-1DNA:
3—阴性对照。
M-DNA Marker(DL 2000) ;
1——阴性对照；
以F4/F4c为引物的套式PCR反应结果M
3—标准EHV-1和标准EHV-4混合DNA标准EHV-4DNA；
标准EHV-IDNA。
4以F/F1c-F4c为引物的套式PCR反应结果10
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