【国家标准】 牛出血性败血病诊断技术

1cs 11. 220
中华人民共和国国家标准
:GB/T27530—2011
牛出血性败血病诊断技术
Diagnostic techniques for bovine haemorrhagic septicaemia2011-11-21发布
中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中国国家标准化管理委员会
2012-03-01实施
本标准的附录A,附录B和附录C为规范性附录。本标准由中华人民共和国农业部提出，本标准由全国动物防疫标准化技术委员会(SAC/TC181)归口，本标准起草单位：甘肃农业大学。GB/T27530—2011
本标准主要起草人：胡永浩、包世俊、伏小平、曾巧英、溢琴，杨学山、邢小勇、郝宝成、项海涛。TTKONKACA
1范围
牛出血性败血病诊断技术
GB/T 27530—2011
本标准规定了牛出血性败血病(bovinchaemorrhagicsepticaemia,HS)的临床与病理学诊断及病原学诊断的方法和技术要求。
本标准适用于口岸、产地及集散地牛出血性败血病的诊断，检疫。2规范性引用文件
下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是泛日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。成是不注日期的引用文件其最新版本适用于本标准。GB/T4789.282003食品卫生微生物学检验染色法、培养基和试剂。3编略语
下列缩略语适用于本标准。
AGID:琼脂凝胶扩散试验(agar gel immunodiffusion tcst）CIEP：对流免疫电泳试验（counterimmunaclcctrophoresistest）CSY：酪蛋白-潮糖-酵母琼脂（casein/sucrose/yeastagar）HS,出血性败血病(haemorrhagic septicaemia)IHA：间接血凝试验（indirect haemagglutination test）PB：磷酸盐缓冲磁（phosphatebulfer）RBCs:红细胞(red hlood cells)4临床与病理学诊断
4.1流行特征
黄牛、水牛、耗牛和奶牛均可感染发病。思病动物、带菌动物为传染来源。有时，健康声禽的口腔、扁桃体和上呼吸道带菌。畜群中发生巴氏杆菌病面查不出传染源时，一般认为象畜在发病前已经带菌。病畜由其排泄物、分泌物排出有毒力的病菌，污染饲料，饮水,用其和外界环境.经消化道而传染给健康家畜。或由咳嗽、喷嚏排出病菌，通过飞沫经呼吸道发生传染。也可通过有伤口的皮肤、黏膜发生传染。吸血昆虫叮咬也可传播病菌。
本病的发生一般无明显的季节性：通常呈散发性流行在畜群中少数几头动物先后发病。水牛，托牛有时可呈地方性流行。发病率、病死率均高。寒冷、问热、潮湿、拥挤、气候剧变、阴雨连绵、围舍通风不良、营养缺乏、饲料突变、过度疲劳、长途运输以及其他疾病、感染等是诱发因素。4. 2临症状
4.2.1败血型：病牛病初体湿高达41C～42，呼吸及心跳加快，鼻镜干裂+皮温不整，食欲减退基至废绝。病初便秘,后腹泻,粪便始呈粥样,后为液状并混有黏液,黏膜片及血液,恶臭。有时出现鼻漏和血尿。胺泻开始后体蕴下降，不久即死亡。病程多为12h～24h。4.2.2浮肿型,除呈现体温升高等一般性全身症状外，病牛颈部、咽喉部及胸前部皮下出现迅速扩展的炎性水肿，同时伴有舌及周围组织的商度肿胀，舌多伸出齿外，呈暗红色。呼吸高度困难，皮肤和黏膜发绀,常因室息或下痫而死。病程多为 12 h～36 h。1
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GB/T 27530—2011
4.2.3肺炎型：除呈现体温升高等一般性全身症状外，病牛主要表现为急性纤维素性胸膜肺炎的症状。体温升高,呼吸困难，干咳，流泡沫样弊液，后弊液呈脓性。胸部叩诊有痛感。病初便秘，后腹泻，粪便恶臭并混有血液。病程一般3d～7d左右。4.3病理剖检
4.3.1败血型：皮下、各部位黏膜、浆膜、肌肉等均有出血点。胸腹腔有大量渗出液。真胃、小肠及大肠常见出血性炎症,肠内容物稀薄且多混有血液。淋巴结显著水肿。脾点状出血但不肿大，肺淤血水肿。
4.3.2浮肿型：咽喉部、颈部及肢体部皮下水肿，切开水肿部位流出深黄色透明液体，间或杂有出血：咽周围组织及会厌软骨树带基黄色胶样浸润，咽淋巴结和前颈淋巴结肿胀。上呼吸道黏膜卡他性炎症。4.3,3肺炎型：胸腔中有大量浆液性纤维索性出液,肺脏和胸膜衰面有小出血点并覆有纤维素膜,肺脏切面呈大理而状。心包与胸膜粘连，内有干酪样坏死物。胃肠道急性卡他性炭症和出血性炎症。淋巴结肿大，呈色，布满出血点，尤以支气管淋巴结与纵隔游巴结最为明显。4.3.4依据流行特征、临床症状以及病理变化可作出初步诊断，确诊要进行病原学诊断。5病原学诊断
5.1病料采集及处理
无菌采集病死动物的体腔出液、血液，肝脏、脾脏，淋巴结等新鲜病料，及时送检或冷暗处保存备用。死亡时间较长的病例可采集长骨骨髓作为病料。可现场制作病料涂片或触片，供染色检。5.2染色镜检
采集病料涂片或触片，染色后置显镜下观察。革兰氏染色（按GB/T4789.28—2003中2.2规定操作)可见革兰氏阴性的短杆菌或球杆菌，南体大小为(0.2um~0.4μm)×(0.6μm～2.5μm)。瑞氏染色（按GB/T4789.28-2003中2.6规定操作）和美蓝染色（按GB/T4789.28—2003中2.1规定操作)时菌体两极嵌染，印度墨汁染色(见附录A)可见明显的美膜。慢性病例或腐败材料常不易发现典型细菌，应该经分离培养后再行染色镜检。镜检观察到典型菌体，结合流行特点、症状和病变，可初步诊断为本病。进一步进行病原分离鉴定以作出确切诊断，
5.3病原分离鉴定
5.3. 1 病原分离
病料分别接种麦康凯琼脂培养基（见附录B)、酪蛋白-蔗糖-酵母(CSY)琼脂培养基（见附录B)和鲜血琼脂培荞基(见附录B),置37C条件下培养18h～24 h后,挑选可疑菌落进行壁定。当病料中细菌合量小时，可用5%血清肉汤（按照GB/T4789.28—2003)于37C进行增菌培养。5.3.2病原监定
5.3.2.1培养特性
多杀性巴氏杆菌在麦康就琼脂培养基上不生长。在血液琼脂培养基上经18h～24h后可长成匾形，光滑、湿润有灰白色光泽的半透明菌落，径约11rm，菌落厨鼠无溶血现象。在CSY琼脂培养基上菌落通常大于血液琼脂培养基上的菌落。老龄培养物，特别是在无血培养基上的老龄培养物，形成的菌落小于血液琼脂培养基上的菌落。5.3.2.2菌体形态
取血液琼脂培养基上生长18h24h的典型菌落涂片，革兰氏染色镜检可见革兰氏阴性的球杆菌，菌体大小为(0,2μm~0. 4μm)×(0, 6 μm~2.5μm)。5.3.2.3生化试验
5.3.2.3.1取纯培养的待检菌少许接种发酵管（见附录B）.登37乙培养，每关观察并记录结果。多杀性巴氏杆菌可分解葡萄糖,果糖、半乳糖、单奶糖、蔗糖和甘薛塘，产酸不产气；不发酵棉子糖、乳糖、鼠李2
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糖、菊糖、水杨苷、肌醇。
5.3.2.3.2MR，VP试验（按GB/T4789.28—2003中3.4规定操作）阴性。5.3.2.3.3吲哚试验（按GB/T4789.28—2003中3.13规定操作)阳性。GB/T 27530-2011
5.3.2.3.4氰化酶试验（按GB/T4789.28—2003中3.18规定操作）、过氧化氢酶试验（按GB/T4789.28—2003中3.20规定操作）阳性，P-半乳糖苷酶试验（按GB/T1789.28—2003中3.3规定操作）、豚酶试验(按GB/T4789,28—2003中3.15规定操作)阴性。5.3.2.3.5硝酸盐还原试验(按GB/T4789.28-2003中3,17规定操作）阳性，柠酸盐利用试验（按GB/T4789.28-2003中3.5规定操作)阴性。5.3.2.3.6硫化氢试验（按GB/T4789.28一2003中3.14规定操作）阴性，明胶液化试验（按GB/T4789.282003中3.10规定操作)阴性。5.3.2.3.7依据病原培养特性、菌体形态、生化试验，符合多杀性巴氏杆菌特征者可作出确定诊断。必要时进行血清分型试验和动物接种试验。5.3.2.4血清分型试验
5.3.2.4.1间接血凝试验
5. 3. 2. 4. 1. 1材料
所用材料如下所示：
标雄菌及待检菌英膜抗原（见附录C)a
特异性抗血清(见附录C)。
1%新鲜绵羊红细胞(见附录C)。
致敏绵羊红细胞（见附录C)。
阿氏液（Alsevers液)（见术录A)。f）80孔血凝反应板（大孔板）。5. 3. 2. 4. 1. 2 方法
间接血凝试验方法步骤如下所示：反应板每排第 1 孔加人 0. 85% NaC1 溶液 0. 72 mL,自第 2 孔起各孔分别加人 0. 85% NaCla)
溶液0.4nL.
各型特异性抗血清各自单独一排稀释,第 1 孔加人血清 0. 08 mL,混勾,移取 0, 4 mI. 到下一孔。同样方法稀释至第7孔。
每孔加人0.1mL致敏绵羊红细胞。同时设如下对照：
-血清对照 :血清(10 倍稀释)0. 4 ml.+加 1%新鲜绵羊红细胞 0. 4 mL。绵羊红细胞对照：1%新鲜绵羊红细胞0.4mL+0.85%NaCl溶液0.4mL。抗原对照:1%致敏绵羊红细胞 0.4 mL十0,85%NaCl溶镀0.4 mL反应程序见表1。
血清需释倍数
间接血凝试验（获膜分型）反应程序2
含0.3%甲醛的0,85YNaC/L
型特异性抗血清加量/ rnL
1%致敏红细胞/mL
1%新鲜红细胞/mL
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8（抗体
对照）
9（抗原
对照）
10（绵羊红
细胞对照）
GB/T 27530--2011
样后，轻微囊荡，置室温，分别于2h～18h判读并记录结果。e）结果判定，绵羊红细胞沿着凹孔坡面呈絮块状凝集为阳性，在孔中央形成钮扣状为阴性。依据凝集范围的大小判定凝巢程度为以下儿级：“十十十十”：凝集颗粒细密并均勾地分布在整个孔底，边缘不整齐，示100%凝集。“+十+”，凝集的绵羊红细胞平铺孔底，但有卷边或缺口，示75%凝巢。一“十十”，觀集的红细胞平铺孔底，呈片层或沙撒布样，分布不均，边缘不整齐，示50%避集。
一：“十+”，绵羊红细胞凝集面积较小，凝集程度轻微，边缘稍增厚，示25%凝集。”二”，绵羊红细胞沉积在孔中央，如小啮盘或钮扣状，示无凝集。以“十+”为样品的滴度终点。当抗原与抗血清之间出现明显50%或50%以上凝集者，判读为阳性，抗源与抗消之间出我25%或无凝集者，判读为阴性。未知菌株用具有凝集性的抗血清进行鉴定，若与所有血清都没有发生凝集反应，则用该方法对菌株无法分型。5.3.2.4.2琼脂凝胶免疫扩试验
5.3.2.4.2. F材料
所用材料如下所示：
a）琼脂。
b）0.85%NaCl搭液。
e）1为硫柳汞溶液。
d）菌体抗原（见附录C)。
e）多杀性巴氏杆菌菌体分型血清，1～16个血清型（见附录C)。5.3. 2. 4.2.2 方法
琼脂凝胶免疫扩散试验方法步骤如下所示：a)琼脂凝胶平板的制备;取 0. 9 g优质琼脂加人 90 raL 0. 85%NaCl 溶液中,加热溶化后再加人1%硫抑汞溶液 1 mL,最后加人适量 0. 85%NaCl 液定容至 100 mL。冷却至 45 ℃~50 ℃,倾注水平放的洁净载玻片、玻璃片或平血<凝胶厚度为2.5mm~3mm)。打孔：琼脂冷凝后打孔，孔径4mm，孔距6mm，每组7孔，如图1所示。孔内琼脂小心用针头b
出，以防破环周围琼脂，随后用酒精灯加热封底。??
图1免疫琼服双向扩散打孔示意图c）加样：中央孔加持检抗原（见附录C中C.5），不同菌体型特异的抗血清加人周边孔内（以加满不溢出为度）。
感作：加样完毕后，静置10min，然后置带盖湿盒中，在37C恒溢培养箱中反应。24h~48hd
观察并判定结果，72h为最终判定时间。结果判定：将琼脂板置于暗背景的自然光下或强光照射下观察。抗原孔与抗血清孔之间出现es
清晰沉淀线者为阳性，未出现沉淀线者为阴性。所有能引起出血性败血病的血清型菌株均能与2型抗血清反应，与5型抗血清也可能发生交叉反应。琼脂胶免疫扩散试验也可用于美膜分型。英膜分型所用的抗原及抗血清与间接血凝法相同（见附录C）。所用琼脂凝胶配成1%浓度(见附录A中A. 5)。
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5.3.2.4.3对流免疫电泳试验
5. 3. 2. 4. 3. 1 材料
所用材料如下所示：
a）英膜抗原(见附录C)。
b)荚膜型性特异性抗血清(见附录 C)。c)巴比要缓冲液(见附录 A)。
d）对流免疫电泳介质(见附录A)。e）0.85%NaCl溶液。
f）电泳仪，打孔器微量加样器。5. 3. 2. 4, 3. 2方法
对流免疫电泳试验方法步骤如下所示：GB/T 27530—2011
琼脂玻片的制备：将12mL电泳介质倾注玻板（57mm×70mm），制成厚度为2mm~3mm电)
泳板。
b）打并：琼脂冷却后打孔，一排7孔，孔径4mm，孔间距7mm，按图2所示。另外设一排对照组，其组内各孔中心之间的距离为5mm。挑去内琼脂，封底。o
图 2对流免疫电泳试验抗原、抗体加样升位置围c）加样：同一组加样孔中，阴极端的孔中加人20μ英膜抗原,同时在的极端的孔中加等量的抗血清。对照组分别用0.85%VaC1溶液与阳性抗血清配对和英膜抗原与阴性免血清配对。d）电泳：电泳槽加人适量pH8.8巴比妥缓冲液，150V(25V/cm）电泳30min，观察电泳出现的沉淀线。
e）结果判定：抗原和抗血清孔之间出现明显的沉淀线者判为阳性，不出现沉淀线者判为阴性。5.3.2.5动物接种试验
将5.1采集的病料用灭菌0.85%NaCI溶液制成1·10悬液（体腔渗出液可直接用于接种,或用5%血清肉汤（按龈GB/T4789.28—2003中4.74)24h的培养渡，皮下或腹腔接种18g~22g键康小鼠4只～8只，每只0.2mL，同时取4只～8只清洁级小鼠注射等量无菌0.85%NaCI溶液作为对照。隔离饲养观紊。多杀性巴氏杆菌强毒株多于12 h~72 h 内致死小鼠。采集死亡小鼠心血和实质脏器,按5.2染色镜检，按5.3进行病原分离鉴定，6诊
当病原学诊断检出多茶性巴氏杆菌时，依据致病特性，结合临床症状和病理变化，即可作出确定诊断。
GB/T 27530—2011
A.1印度墨汁染色
A 1. 1 试剂;印度墨汁。
附录AbzxZ.net
（规范性附录）
溶液发电泳介质的配制
A.1.2操作：将标本与一滴印度墨汁染色液在裁玻片上混合，加盖玻片，轻压一下，使标本混合液变薄，在显微镜下观察。
A. 2 阿氏液(Alaever’s液)
A.2.1成分
葡萄糖
柠檬钠(C,HNa.O,5H20)
柠檬酸(C,H.O,·H,O)
A.2.2制法
上述成分加蒸馏水至100mL，混合过滤，116灭菌15min备用。A.30.2 mll/L磷酸盐缓冲液(PB)A.3.1成分
NH.PO,-2H,0
NaHPO4-12H,0
A3.2制法
先配制 0.2 mol/L的 NaH,PO,(A被)和0.2 mol/L的 Na:HPO.(B),两者按一定比例混和即成o.2mol/L磷酸盐缓冲液。
A液：称取 NaHzPO.·2H,O 31.2 g+加双蒸水充分溶解定容至1 000 mL。B液：称取Na2HPO,：12H.071.632g,加双蒸水充分溶解定容至1000mL取 A被 19, 0 mL,B液 81, 0 mL 混合后摇勾即得 0. 2 mol/1.,PH7. 4 的 PB。A.4巴比妥醋酸盐冲液（巴比妥缓冲液）巴比妥钠 29. 24 g,无水醋酸钠 11. 70 ,0. 1 rmo1/L 盐酸 180 mL,加蒸馏水到 3 L,调整 pH 为 8. 8A.5对流免疫电泳介质
对溉免疫电泳介质成分：琼脂糖20g，巴比妥钠2.06客，二乙基巴比妥酸0.37g，蒸馏水180mL及0.01%的碱柳录20mL。
B.1麦康凯琼脂培养基
附录B
（规范性附录）
培养基的配带
称取适量干麦康凯琼脂培养基，按使用说明制作培养乎板。B. 2酪蛋白-藤糖-酵母(CSY)琼脂培养基B.2.1 成分
水解酪蛋白
醇母没膏
氯化钠
无水磷酸氢二钾
B. 2. 2制法
GB/T27530-2011
加蒸馏水至1L，完全溶解后调pH值至7.3~7.4后加入1.5%琼脂，116C高压灭菌15min。冷却至45亡～50它时加入5%的牛血清并癫注平血制成平板培养基。B.3鲜血琼脂培养基
B.3. 1成分
牛肉膏
蛋白藤
氯化钠
磷酸氢二钾
琼脂粉
燕馏水
B.3.2制法
1000mL
先将牛肉膏、蛋白陈,氯化钠和磷酸氢二-钾溶于蒸馏水,调 PH 至 7. 4 ~7. 6,再加人琼脂粉,混匀并高压灭菌后，冷却至50时加入无菌脱纤家免鲜血5%，充分混合后倾注平血制成平板培养基。B. 4糖发酵管
B. 4. 1 成分
蛋白陈
無化钠
糖(醇、苷)
0.2%的漠香草酚蓝溶綫
蒸馏水
B. 4. 2制法
1000ml
各成分加热溶于水中并调pH至7.4，分装域管，116C高压灭菌15min。7
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C.1英膜抗原制备
附录C
（规范性附录）
多杀性巴氏杆菌分型抗原及致敏绵羊红细胞的制备方法将参考菌株（待检菌株）6h～Bh肉汤培养物1mL均匀涂布到CSY血液琼脂乎血上（直径90mrm).37培养过夜。用3mL含0.3%甲醛的0.85%NaCl溶液将生长物洗下,56七加热30min后，4℃3000g离心15tmin，收集上清液保存在一20C备用。若没有冷冻离心机，则1500g离心30 min，上猜被作为抗原提敢物。C.2不同英膜型特异性抗血清的制备和处理6.2.1旬备
将CartorA,B,D,E标准菌株分别接种于CSY血液琼脂培养基上，37C培养18h～20h，用含0.3%甲醛NaCI溶液将生长物洗下，将菌体悬液的法度调到与布朗氏比独臂的第4管相同。每间隔3d~4d给免静脉内注射菌液一次，注射量分别为0.2ml、0.5mL、1.0mL、l,5mL及2.0mL，最后一次注射后1周,取0.5mL相同的活菌总液，给兔皮下或肌肉接种。10d后采血收案血清，血清保存于一20℃，而常用的少量血清可加人硫柳汞至0.01%，4℃保存。C.2.2处理
用前将1份压积绵羊红缅胞加人3份血清中，室温作用30min，离心除去绵羊红细胞，经56七灭活30in即可：
C.3新鲜绅羊红细胞的制备
无菌采取绵羊血液，脱纤后，用6倍8倍的0.85%VaCI溶液洗涤3次，每次皆用离心法收集编羊红细胞（500g），最后一次收集的绵羊红细胞，应恢复到原血量的一半置2～8℃保存，2d内使用。
C.4致敏绵羊红细胞的制备
取3mL英膜抗原（见附录C中C.1)，加入0,2mL洗净的绵羊红细胞(见附录C中C.3),充分混勾37℃振劳作用2h，离心去上清，再用10mL0.85%NaCl溶液洗涤一次，离心悬浮于20mL0.85%Nac1落液，即为1%的致敏绵羊红细胞感液。C.5蕾体抗原制备
将细菌接种血液晾脂平板培养24h 后,用 1mL含 0.3%甲醛的8.5% NaCI溶液冲洗并收获生长物。悬浮液100℃水浴中加热1h，离心弃沉淀，取上清液即为琼脂凝胶免疫扩散试验抗原。C. 6菌体分型抗血清的制备
12周龄～16周龄公鸡颈中部皮下接种1mL油乳菌苗（油乳菌苗制苗菌梯选用分离自牛的6：B8
GB/T 27530—2011
型多杀性巴氏杆菌，制备方法参见中华人民共和国兽药典》（2005年版三部）*禽多杀性巴氏杯菌病
油乳剂灭活疫苗\),3 开后胸部脏肉内再接种 1 mL(在胸骨的两侧各接种 0. 5 mL)。1 周后采血,分离血清，并如0,01%巯柳汞或0.%右炭酸防痴保存。出现交叉友应的血落应弃去d
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