【国家标准】 马接触传染性子宫炎诊断技术

1CS11.220
中华人民共和国国家标准
GB/T 275292011
马接触传染性子宫炎诊断技术
Diagnostic lechinigues for contagious eguine metritis2011-11-21发布
中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中国国家标准化管理委员会
2012-03-01实施
本标准的附录A.附录B、附录心为规范性附录。本标由中华人民共和国农业部提出本标准由全国动物防疫标准化技术委员会(SAC/TC181)归几。GB/T 27529—2011
本标准起草单位：中华人民共和国山东出人境检验检疫局、中华人民共和国新疆出人境检验检疫局。
本标准主要起草人：朱来华、梁成珠、郑小龙、肖西志、邓明俊辛学谦、谭乐义、方绍庆，正宫璞、岳志片、季新成、王群、孙涛、赵玉然。1
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1范围
马接触传染性子宫炎诊断技术
CB/T27529—2011
本标准规定了马接触传染性子言炎(contagiousquine metritis,CEM)的诊断技术。本标准适用于马接融触传染性了宫炎的诊断和检疫。2规范性引用文件
下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修政（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些义件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GB/工1789.28一2003食品卫生微生物学检验染色法.培养基和试剂GB/T 6682分析实验室用水规格和试验方法3临床检查
3. 1临床特征
公马感染马牛殖道泰勒氏杆菌后不丧现任何临床症状，当母马感染后表现阴道炎、子宫颈炎，初期外阴部山现大量渗出物或灰色炎症分泌物，后期渗山物或分泌物逐渐变成黏调的嵌液，其中含存大量的多细胞、黏膜脱落细胞和崩解的细胞碎片。3. 2判定
根据3.1临床检查可作山初步判定，为了确诊需进行实验室检查，细菌学检查是确诊本病最可靠的方法，
4病原分商与初步鉴定
4.1材料准备
4. 1. 1器材
4. 1. 1. 1 微量移液。
二氧化碳培养箱
4. 1. 1. 2
4. 1. 1. 3
普通冰箱及低温冰箱（4℃、—20℃）。商心管。
4. 1. 1. 4
4. 1. 1. 5
4. 1. 1. 6
4. 1. 1. 7
普通尘物显微镜，
暗祝野或相差显徽镜。
载玻片。
4. 1. 1. 8接种环。
4. 1.1.9擦镜纸。
4. T. 2实验室用水
实验室用水是指实验室用于溶解，稀释或配制裕液的水，可用多饮蒸馏或离子交换等制备，衬合GB/T6682二级水要求。
4.1.3培养基
4.1.3.1运输培养基：见附录A。4.1.3.2选择性琼脂培养基见附录A。1
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GB/T 27529—2011
4.1.3.3含硫酸链雾素(200Fg/mL)选择性琼脂培养基：见附录A。4.1.3.4卵黄氯化钠凉脂培养基：见附录A。4.1.4试剂
4.1.4.1除特别说明以外，本标推所用试剂均为分析绝。4.1.4.2革兰氏染色液：按GB/T4789.28—20034r2.2规定配制。4,1.4.3过氧化物酶试检试剂：按GB/T4789.28—2003中3.18规定，临用时配制。4.1.4.4氧化酶试验试剂，按GB/T4789.282003中3.20规定临用时配制，于冰箱内避光保存。4.2样品采集和运送
在采集秘尿生殖道拭子前应至少停用抗牛素药物了d，也不得使用消毒药物冲洗密尿生殖道。母马或公马保定后用高压消毒的棉拭了刮擦秘尿生殖道黏膜（尿道隐窝、尿道窦，尿道或阴茎鞘）以刮取含有细跑，分泌物的样品。从阴蒂窝和阴蒂窦刮取拭了进行分离培养即可证明马生殖道泰勒氏杆菌的存在，但要获得纯净的塔养物，应从子宫颈或子官内膜中采集样品来分离。公马：每匹公马分别从阴蔻基部/包皮处（包皮折）、尿道隐窝/尿道案、康道口采集3份拭了。未怀孕母马：每匹母马分别从子宫颈、阴蒂意窝.阴蒂窦采集3份拭子。怀孕母马：每匹母马分别从阴带隐窝，阴蒂窦来集2份拭子，棉拭子采巢后,迅速插人装有1mL～2mL含活性炭的运输培养基离心管内，以吸附掉细菌代谢产生的抑制因子
在低温条件（2℃~8）下，样品尽快（21h~48h内）送往实验室。4.3病原分离培养bZxz.net
样品到达实验室后，立即用棉拭子蘸取样品液直接涂布子选择性琼脂培养基和含硫酸链霉素（200μg/mL）选择性琼脂培养基平板上，每个拭子均接种2个平板。平板在5%～10为的二氧化碳培养箱内35℃～37培养，最初24h应查是否有杂菌污染。48 h 庐做每天观察,培养7d~I4d.4.4病原初步鉴定
4.4.1菌落鉴定
48h后应将天观察鲸脂培养基，观察培差基上有无疑似特征性菌落。马生殖道泰勒氏杆菌的菌落狠小.直径2mm~3mm，边缘完整光滑，行光泽，呈浅灰黄色，如无特征性菌落，可弃之。4.4.2草兰氏染色鉴定
按B/4789.282003中2.2规定操作。4.4.3湿片动力试验
取下净载玻片一快，用微量液器加一滴生理盐水，无菌挑取少量菌落，涂抹分散均匀。使用暗视或相差显微镜检查，先用低倍物镜，再用高倍物镜，观察细菌形态特征与动力特征。4.4.4生化整定
4.4.4.1氧化酶试验
取典型菌落，按GB/T4789.28—2003中3.18规定操作。4.4.4.2过氧化氢酶试验
取典型菌落，按GB/T4789.28—2003中3.20规定作，4.4. 4.3磷脂酶试验
用接种环挑取固体培养基上典型菌落，点种于卵黄氯化钠琼脂平板（每张平板至少可接种10点）在5%～10%的二氧化碳培养箱内37厌氧培养24h，观察接种点的变化，磷脂酶试验阳性者产生卵磷脂酶,分解卵黄中的卵磷脂,接种点的底部及局围形成乳白色的混浊带。
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4.5结果判定
CB/T 27529—2011
4.5.1根据细菌的菌落持征、革兰氏染色特征、湿片动力试验、过氧化氢莓试验、磷脂游试验和氧化酶试验的结果可进行初步鉴定。
4.5.2马生殖道泰勒氏杆菌生长缓慢，菌落很小，直经2mm~3mm，边缘完整光消，有光泽，呈浅灰黄色。
4.5.3马生殖道泰勒氏杆菌革兰氏染色阴性，杆状或球杆状，有时呈多形态（长达6Mm），并可表现两极着。
4.5.4马生殖道泰赖氏杆菌无运动性4.5.5马生殖道泰勒氏杆菌能产生过氧化氢酶和磷酸脂酶，氧化酶强阳性，无其他牛化反应。4.5.6凡符合马牛殖道泰勒氏杆菌一般特征租生化特性的细菌，可初步判定为马生殖道秦勒氏杆菌，奶初步判定为马生殖道泰勤氏杆菌，则需要进··步应用马生殖道泰氏杆菌特异抗血清进行血清学鉴定。
5病原血清学鉴定技术
5.1玻片乳胶凝集试验
5.1.1试验材料
5.1.1.1马生殖道泰勒氏杆的标准抗原5.1.1.2马生殖道泰勒氏杆菌阳性血清致敏乳胶。5.1.1.3马生殖道泰勘氏杆菌阴性血清致敏乳胶。5.1.1.4载玻片。
5.1.1.5玻璃铅笔。
5.1. 1.6接种环。
5.1.1.7牙签或火柴杆。
5.1.2操作程序
使用前，马生殖道泰氏杆菌的标推抗原应充分振荡，所有试剂在室温平衡使其温度达到20“左右。
取洁净玻片…-块,用玻璃铅笔划成小格。滴加1滴马生殖道泰勘氏杆菌阳性血清致敏乳胶（约25μ1.）.再用接种环在琼脂培养基上钩取待鉴定细菌培养物适量，战滴加1滴液体培养物（约25μL）。同时下载玻片一端滴加1滴马生殖道氏杆菌阴性血清致嫩乳胶，间样钩取该细菌培养物混约于其申。
以牙签或火柴杆混匀,在3min--5 min内判定结果5. 1. 3结果判定
“十十十一”，100%集，全部乳胶凝集，成絮状团，出现大的凝集片或粒状物，液体清亮，*十十十”：75%凝集，大部分乳胶凝集成较小的颗粒，有可见凝集块，液体清亮，几乎完全透明，“一+”：50%凝集，半量乳胶凝集成细小颗粒，出现比较明显的颗粒状凝集颗粒或小疑块·液体不甚透明。
“十”25为凝集，仅可勉强看到粒状物，或较少量的乳胶避集成可见的细颊粒，液体浪独。“”：尤凝集现象，全部乳胶液体仍为均匀混浊，无颗粒。以“十十\或以上的反应强度作为该反应滴度的终点，判为凝集试验阳性。5.1.4结果说明
玻片乳胶凝集试验因可能出现非特性凝集反应·仅用做马生殖道泰献氏杆菌的初步血清学鉴定。3
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GB/T 27529—2011
5.2°间接荧光抗体法
5.2.1试验材料
5.2.1.1马生殖道泰勒氏杆菌的标准抗原，5.2.1.2马生殖道泰杆菌荧光标记的标准阳性血清。马生殖道泰勒氏杆菌标准阴性血清。5.2. 1. 3
5. 2. 1. 4异统鼠酸荧光(FITC)标记的抗抗体诊断液。5.2.1.50.1mo1/LpH8.0磷酸盐缓冲液(PBS)(见附录B)。5.2.1.6甘油缓冲液(附录B)。
丙酮:乙醇(体积比1=1. 一20 ℃预冷）。3恒温培养箱。
5.2. 1. 8
5.2.t.9荧光显薇镜，
5. 2. 1. 10
5. 2. 1. 11
5.2. 1. 2
5. 2. 1. 13
5. 2. 1. 14
载玻片、
盖玻片。
玻璃铅笔。
接种坏。
镊子。
5. 2. 1. 15
染色缸。
5.2.2操作程序
取一干净载玻片，用玻璃铅笔画定样品区域（直径0.5cru）用接种环在琼脂培养基上钩取待鉴定细菌培养物适量，涂布均句，风于，同时以马生殖道泰勤氏杆菌的标抗原作为阳性对照。待涂片似干米干时，滴加冷丙酮：乙醇液，固定细胞5min--10min。用镊子将载玻片放人PBS液染色缸中充分漂洗，经过3次，每次3min～5min将载玻片上多余的水擦干，分别10L马生殖道泰勒杆菌的标准阳性血清.标准阴性血清（事先用PBS稀释10倍~-20倍）滴于标本上，放于邀盒内，37C温育30min。将载坡片上多余的水份擦干，滴加10μL.异硫氰酸荧光素（FITC)标记的抗抗体诊断液（以PBS稀释至工作效价)，并使它布满整个标本。置湿盒中，放37C温箱，作用30min.取出玻片，用PBS充分票洗，经过3次，每次3mi~5min：将载玻片上多余的水份摔干，在标本处滴一-小滴甘油缓冲液，轻轻加上盖玻片。5.2.3结果判定
将载玻片放在荧光显徽镜载物台上.调好光源即可观察，阳性反应省FITC荧光色素呈明亮的黄绿色荧光。
5.2.4结果说明
间接荧光抗体法因特异性强、灵敏度高，可用做马生殖道泰勒氏杆菌的最后确诊，6病原套式PCR分子鉴定
6.1材料与试剂
6.1.1仪器与器材
6.1.1.1PCR扩增仪。
6.1.1.2高速台式冷冻离心机（离心速度12000r/min以上）。6.1.1.3台式离心机（离心速度2000r/min)。6.1.1,4据句器。
6.1.1.5冰箱(2℃~～8℃和-20℃两种)。6.1.1.6微量可调移液及配套带滤芯吸头。A
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6. 1. 1. 7EppendorI 管(1. 5 mL 带盖塑料离心符) ,6.1.1.8稳压稳流电泳仪和水平电泳槽。6.1.1.9电泳凝胶成像系统（或紫外分析仪），6. 1. 2试剂
6. 1. 2. 1蛋白酶 K: 见附录 C。10%SDS液，见附录C。
6. 1. 2. 2
6. 1. 2. 3
6. 1. 2. 4
6. 1. 2. 5
6. 1. 2. 6
6. 1. 2. 7
6. 1. 2. 8
6. 1. 2. 10
6. 1. 2. 11
6. 1. 2. 12
6. 1. 2. 13
异丙醇一20℃预羚。
NaAc(3mol/L）：见附录C.
75%乙醇：见附录C,
Taa酶:5U/μL
10X PCR 缓冲被。
dNTPs:含有 dATP,dTTP,dCIP.dGTP 各 2. 5 mmol/I.。GB/T 27529—2011
电泳缓冲液：用5XTBE电泳缓冲液稀释成工作浓度，即0.5XTBE缓冲液（见附录C)。FB:见附录 C。
加样缓冲液(6×）):见附录 C。0. 1 mol/L PBS(pH8, 0) : 见附录 R,引物：加灭菌蒸溶水配制成204m01/L工作液（见表1)。表 1 套式 PCR 引物序列
上游外划引物
上游内引物PP2
下游物PR1
6. 2DN4 模板的制备
5*-CCATTAGAGGCTGTTAATCAATCGGGAAACC-3'5'-CCATALCGAACCCAAIACCAAGCACACAAG-3'5'-GTGTCATTAAGGTGTGTATETGGTCTGGTG-3在 15S IRNA 位置
215-214
482-453
取 n 个灭菌的 1. 5 mL Eppcndorf 管,其中 π 为被检样品、阳性对照与阴性对照的和(阳性对照,阴性对照在试剂盒中已标出）.编号。用微量可调移液器十每管加pH7.0PBS1mL，将生殖道拭子漫泡、挤压后，子4℃15000r/m离心1min，去上清液。
用微量可调移液器于每管加人蛋白酶K至终浓度100Hg/tmL和SDS至终浓度10g/L，55C水浴2h.
用微量可调移液器于每管分别加入苯酚、苯酚-氟伤-异丙醇混合液(体积比为 25 ± 24：1)、氧仿,在混勾器上剧烈滤句，各抽提1次，吸取水柑转移至新Eppendorf管。用量可调移液器及配套带滤芯吸头于每管加入1/10体积3raol/L的NaAc和2.5倍体积的无水Z醇,轻轻混勺后置一20℃沉淀 1h,4 亡条件下 12 000 1/min 离心15 tmin,弃掉上清液。用微量可调移液器于每管加入75%乙醇洗涤，1℃条件下12000r/min离心5min.沉淀烘干后感浮于水中，取适量用作PCR模板。若需长期保存应放置一70℃冰箱。6. 3半套式 PCR 程序
6. 3. 1 第一次 PCR 反应
第一次PCR反应液组成如下，
10×FCR缓冲液
MgCl,(25 mmol/L)
dNTP(2.5 mmol/L)
引物 PP1<20 μmol/L3
GB/T 27529—2011
引物PR1(20 μmol/L)
Iag 酶((5 U/μL))
DNA模板（10ng/μL)
在PCR管内加人上述成分，总体积为50μL，3000z/min离心10s。将PCR反应管置于PCR增仪先95℃5min.再进行95C30,58℃3072℃30，35次循环，然后72C10min，最4℃保温。6. 3.2第二次 PCR反应
第一次PCR反应液组成如下：
10×PCR缓冲液
MgCl, (25 mol/L)
dNTP(2. 5 mmol/L)
引物 PP2(20 μmol/L)
引物PR1<20μmnl/L)
Taq 酶(( U/μL))
DNA模板（10ng/μL)
0. 5 μl.
第一次PCR产物在带稳压稳流电泳仪的水平电泳内进行琼脂糖胶电后，在电泳凝胶成像系统（或紫外分析仪)上进行观案。如果不出现445Ep的DNA扩增条带，取2L产物做模板；如果电后山现445bp的DNA扩增条带，则需将产物按1：1000稀释后，取2μI.作为第二次PCR的模板。在PCR管内加人上述成分，总体积为50μL,3000r/min离心10s，将PCR反应管置于PCR拟增仪。先95℃5min，再进行95℃30.62℃30s、72℃30s,35次循环.然后72℃10min，最后4℃保温。6.3.3对照设立
从6.2DNA模板的制备开始，设立阳性对照阴性对照。以含有已知马生殖道泰勒氏杆菌NCTC11184株的细菌总液作为阳性对照，蒸增水作为阴性对照。6.3.4PCR产物琼脂糖电泳
用TBE电冰缓冲液配制2%的琼脂糖（含0.5g/mI.EB)平板，将板放人水平电泳-使电泳缓冲液刚好淹没胶面。将10μL样品和2μL加样冲液（6×）混勾后加入样品孔。在电泳时设立DNA标准分了量作对照。5V/cm电泳约30min，当溴酚蓝到达底部时停IF。在紫外灯下观察钻果。6.4结果判定
第…-次PCR后阳性对照会出现一条445bp的DNA片段，阴性对照则无。第二次（半套式)PCR庐，阳性对照会出兜一条238bp的DNA片段，阴性对照则无。待测释品PCR扩增后，如能在相应145bp,238bp位置上出现DNA条带，即可判定为阳性反应。必要时对扩增产物进行序列测定与比对。6. 5结果说明
套式PCR技术因待异性强、灵敏度高，结合PCR序列测定、比对，亦可用做马生整道泰勒氏杆菌的最后确诊。
A.1运输培养基
薰化纳氯化钾（KC1)
氯化钙（aCl）
氯化镁(MgCl.)
磷酸二氢钾(KH.PO.)
磷酸氢二钠(Na,HPO,)
筑基乙酸钠(C,H.NaO.S)
活性炭
附录A
（规范性附录）
培养基配制方法
GB/T 27529--2011
称取上述成分，加人蒸缩水定容到1000ml..稍加热溶解后107.9kPa、121℃高压灭菌15rain。2选择性琼脂培养基:5%(体积分数)热灭活血液巧克力琼脂培养基A.2
蛋白陈
牛肉没膏
氯化钠
加入900mL热罐水，加热济解后107.9kPa.121C商压灭菌15min。冷至70℃～~80℃时，加人 50 mL 马血液,70 ℃～80 ℃水浴 12min,期间不断旋端:继续冷却到 45 ～50 ℃,加入 1 mL 的100rag/mL半胱氨酸（终浓度0.83mol/L）、1ml.的277mg/mL亚硫酸钠（终浓度1.59mol/L）、=甲氧芋二.氨嘧啶（1g/mL）、洁霉素（5P/mI.）和两性霉素B（5μg/mL.）、以灭菌蒸缩水定容到1000mL；充分搬播，倾注平血，厚度约为4tILI即可获得高质量的巧克力琼脂培养基。A.3含硫酸链素（200g/mL）选择性琼脂培养基在5为（体积分数)热灭活血液琼脂培养基的基础1.添加硫酸链套素（200g/mL）。A.4卵黄氟化钠琼脂培养基（磷脂醇试验用）A.4.110%氟化钠卵黄液的潮备
取新鲜鸡蛋1个，以无菌操作取出邸黄，加入10头灭菌氯化钠荠液100m1.中，充分摇，即得，A.4.2卵黄氟化钠琼脂培养基
蛋白豚
牛肉没出粉
氯化钠（NaCI)
蒸馏水
10%氯化钢卵黄液
650 mL
100 mL
取上述成分（除10头氟化钠卵黄液外)混合，加热溶化琼脂，调节pH值为7.6，107.9kPa121℃高压灭菌15min.待冷至约60℃，以无菌操作加入10%氯化钠卵黄液100mL，充分振据倾注平。GB/T27529—2011
（规范性附录）
间接荧光抗体试剂配制方法
B.10.1mol/L磷酸盐缓冲液(PBS,pH8.0)磷酸氢二钾
磷酸二氢钾
取磷酸氢二钾5.59g与磷酸.氢0.41g，加蒸馏水定容至1000mL.,充分溶解即可。甘油缓冲液
0.1 mol/LPBS(pH8.0)
取 90 mL 甘油圳 10 mL pH8. 0 PBS充分混匀,即甘油缓冲液00
C. 1蛋白酶K(10 mg/mL)
蛋白酶 K
蒸灌水
附录C
(规范性附录）
PCR试剂配制方法
50mg蛋白酶K溶于5mL蒸馏水中，分装成每管1ml，一20保存。c.210% SS
SDS(十二烷基磺酸钠)
蒸馏水
1 000 mL
CB/T 27529—2011
100 SDS在 900rnL水中溶解,加势至68℃助溶：射水定容至1000 m,笔温保存。C. 33 mol/L 醋酸钠
408醋酸钠(NaAc·3H0），在900mL水中溶等：加水定穿至1000mL，室温保存。107.9kPa、121C高辰灭南15 min.
C.475%Z醇
燕馏水
无水乙醇
用无水乙醇和蒸水充分混匀，-·20℃预冷。C.55×TBH电泳缓冲液(5×敬缩液）Tris
加三蒸水到
1 co0 mL
用5 mol/L的盐酸(HC1)调到 pH8. 0,或直接购买商品化的产品C.6EB(染色剂)
溴北乙锭(EB)
蒸馏水
用二蒸水配制成10mg/mL.的浓缩液，使用时每10mL琼脂溶液中加1μL，C.7 加样缓冲液(6×)
漠酚蓝
蒸馏水
10o mL
称取溴龄蓝 0.25 g 和蔗糖 40 B+充分溶解于80 ml. 蒸溜水,最后定容至 100 mL。107. 9 kPa.121高压火菌15min
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