【国家标准】 食品安全国家标准食品微生物学检验 大肠菌群计数

中华人民共和国国家标准
GB 4789.3—2010
食品安全国家标准
食品微生物学检验大肠菌群计数National food safety standardFoodmicrobiologicalexamination:Enumerationofcoliforms2010-03-26发布
中华人民共和国卫生部
2010-06-01实施
本标准代替GB/T4789.3-2008《食品卫生微生物学检验大肠菌群计数》本标准与GB/T4789.3-2008相比，主要修改如下：修改了标准的中英文名称；
GB4789.3—2010
“第二法大肠菌群平板计数法”的平板菌落数的选择范围修改为“15CFU～150CFU”；删除了“第三法大肠菌群PetrifilmTM测试片法”。本标准的附录A、附录B为规范性附录。本标准所代替标准的历次版本发布情况为：GB4789.3-1984、GB4789.3-1994、GB/T4789.3-2003、GB/T4789.3-2008。I
1范围
食品安全国家标准
食品微生物学检验
大肠菌群计数
本标准规定了食品中大肠菌群（Coliforms）计数的方法。本标准适用于食品中大肠菌群的计数。术语和定义
2.1大肠菌群coliforms
GB4789.3—2010
在一定培养条件下能发酵乳糖、产酸产气的需氧和兼性厌氧革兰氏阴性无芽胞杆菌。2.2最可能数mostprobablenumber，MPN基于泊松分布的一种间接计数方法。3设备和材料
除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下：3.1恒温培养箱：36℃±1℃。
3.2冰箱：2℃~5℃。
恒温水浴箱：46℃±1℃。
天平：感量0.1g。
5均质器。
振荡器。
无菌吸管：1mL（具0.01mL刻度）10mL（具0.1mL刻度）或微量移液器及吸头：无菌锥形瓶：容量500mL。
无菌培养皿：直径90mm。
pH计或pH比色管或精密pH试纸。3.11
菌落计数器。
4培养基和试剂
月桂基硫酸盐胰蛋白陈（LaurylSulfateTryptose，LST）肉汤：见附录A中A.1。2煌绿乳糖胆盐（BrilliantGreenLactoseBile，BGLB）肉汤：见附录A中A.2。4.2
结晶紫中性红胆盐琼脂（VioletRedBileAgar，VRBA）：见附录A中A.3。4.4
磷酸盐缓冲液：见附录A中A.4。5无菌生理盐水：见附录A中A.5。4.5
无菌1mol/LNaOH：见附录A中A.64.7无菌1mol/LHCl：见附录A中A.7。GB4789.3—2010
5检验程序
第一法
大肠菌群MPN计数法
大肠菌群MPN计数的检验程序见图1。检样
25g(mL)样品+225mL稀释液，均质10倍系列稀释
选择适宜3个连续稀释度的样品勾液，接种LST肉汤管36℃±1℃
不产气
48h±2h
BGLB肉汤
36℃±1℃
不产气
大肠菌群阴性
48h±2h
大肠菌群阳性
查MPN表
报告结果
图1大肠菌群MPN计数法检验程序6操作步骤
6.1样品的稀释
GB4789.3—2010
6.1.1固体和半固体样品：称取25g样品，放入盛有225mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质杯内8000r/min～10000r/min均质1min～2min.或放入盛有225mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1min～2min，制成1:10的样品匀液。6.1.2液体样品：以无菌吸管吸取25mL样品置盛有225mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌锥形瓶（瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠）中，充分混勾，制成1:10的样品匀液。6.1.3样品勾液的pH值应在6.57.5之间，必要时分别用1mol/LNaOH或1mol/LHCI调节。3
GB4789.3-—2010
6.1.4用1mL无菌吸管或微量移液器吸取1:10样品匀液1mL，沿管壁缓缓注入9mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌试管中（注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面），振摇试管或换用1支1mL无菌吸管反复吹打，使其混合均匀，制成1:100的样品匀液。6.1.5根据对样品污染状况的估计，按上述操作，依次制成十倍递增系列稀释样品匀液。每递增稀释1次，换用1支1mL无菌吸管或吸头。从制备样品勾液至样品接种完毕，全过程不得超过15min。6.2初发酵试验
每个样品，选择3个适宜的连续稀释度的样品勾液（液体样品可以选择原液），每个稀释度接种3管月桂基硫酸盐胰蛋白陈（LST）肉汤，每管接种1mL（如接种量超过1mL，则用双料LST肉汤），36℃±1℃培养24h+2h，观察倒管内是否有气泡产生，24h+2h产气者进行复发酵试验，如未产气则继续培养至48 h+2h，产气者进行复发酵试验。未产气者为大肠菌群阴性。6.3复发酵试验
用接种环从产气的LST肉汤管中分别取培养物1环，移种于煌绿乳糖胆盐肉汤（BGLB）管中，36℃±1℃培养48 h+2h，观察产气情况。产气者，计为大肠菌群阳性管。6.4大肠菌群最可能数（MPN）的报告按6.3确证的大肠菌群LST阳性管数，检索MPN表（见附录B），报告每g（mL）样品中大肠菌群的MPN值。
第二法大肠菌群平板计数法
7检验程序
大肠菌群平板计数法的检验程序见图2。检样
25g(mL)样品+225mL稀释液，均质10倍系列稀释
选择2个~3个适宜稀释度的样品匀液，接种VRBA平板36℃±1℃
18h~24h
计数典型和可疑菌落
BGLB肉汤
36℃±1℃
24h~48h
报告结果
图2大肠菌群平板计数法检验程序8操作步骤
8.1样品的稀释
按6.1进行。
8.2平板计数
GB4789.3—2010
8.2.1选取2个～3个适宜的连续稀释度，每个稀释度接种2个无菌平皿，每皿1mL。同时取1mL生理盐水加入无菌平血作空白对照。
8.2.2及时将15mL～20mL冷至46℃的结晶紫中性红胆盐琼脂（VRBA）约倾注于每个平皿中。小心旋转平皿，将培养基与样液充分混匀，待琼脂凝固后，再加3mL～4mLVRBA覆盖平板表层。翻转平板，置于36℃±1℃培养18h～24h。8.3平板菌落数的选择
选取菌落数在15CFU～150CFU之间的平板，分别计数平板上出现的典型和可疑大肠菌群菌落典型菌落为紫红色，菌落周围有红色的胆盐沉淀环，菌落直径为0.5mm或更大。8.4证实试验
从VRBA平板上挑取10个不同类型的典型和可疑菌落，分别移种于BGLB肉汤管内，36℃C±1℃培养24h～48h，观察产气情况。凡BGLB肉汤管产气，即可报告为大肠菌群阳性。8.5大肠菌群平板计数的报告
经最后证实为大肠菌群阳性的试管比例乘以8.3中计数的平板菌落数，再乘以稀释倍数，即为每g（mL）样品中大肠菌群数。例：10-样品稀释液1mL，在VRBA平板上有100个典型和可疑菌落，挑取其中10个接种BGLB肉汤管，证实有6个阳性管，则该样品的大肠菌群数为：100×6/10×10°/g（mL）=6.0×10CFU/g（mL）
A.1月桂基硫酸盐胰蛋白陈（LST）肉汤A.1.1成分
胰蛋白陈或胰酪陈
氯化钠
磷酸氢二钾（K,HPO4）
磷酸二氢钾（KH,PO4）
月桂基硫酸钠
蒸馏水
pH6.8±0.2
A.1.2制法
附录A
（规范性附录）
培养基和试剂
1000mL
GB4789.3—2010
将上述成分溶解于蒸馏水中，调节pH。分装到有玻璃小倒管的试管中，每管10mL。121℃高压灭菌15min。
煌绿乳糖胆盐（BGLB）肉汤
A.2.1成分
蛋白陈
牛胆粉（oxgall或oxbile）溶液0.1%煌绿水溶液
蒸馏水
pH7.2±0.1
A.2.2制法
将蛋白陈、乳糖溶于约500mL蒸馏水中，加入牛胆粉溶液200mL（将20.0g脱水牛胆粉溶于200mL蒸馏水中，调节pH至7.0~7.5），用蒸馏水稀释到975mL，调节pH，再加入0.1%煌绿水溶液13.3mL，用蒸馏水补足到1000mL，用棉花过滤后，分装到有玻璃小倒管的试管中，每管10mL。121℃高压灭菌15min。
结晶紫中性红胆盐琼脂（VRBA）A.3
A.3.1成分
蛋白陈
酵母膏Www.bzxZ.net
氯化钠
胆盐或3号胆盐
中性红
结晶紫
蒸馏水
pH7.4±0.1
15g~18g
1000mL
A.3.2制法
GB4789.3—2010
将上述成分溶于蒸馏水中，静置几分钟，充分搅拌，调节pH。煮沸2min，将培养基冷却至45℃～50℃倾注平板。使用前临时制备，不得超过3h。A.4磷酸盐缓冲液
A.4.1成分
磷酸二氢钾（KH,PO4）
蒸馏水
A.4.2制法
贮存液：称取34.0g的磷酸二氢钾溶于500mL蒸馏水中，用大约175mL的1mol/L氢氧化钠溶液调节pH，用蒸馏水稀释至1000mL后贮存于冰箱。稀释液：取贮存液1.25mL，用蒸馏水稀释至1000mL，分装于适宜容器中，121℃高压灭菌15min5无菌生理盐水
A.5.1成分
氯化钠
蒸馏水
A.5.2制法
1000mL
称取8.5g氯化钠溶于1000mL蒸馏水中，121℃高压灭菌15min。A.6
51mol/LNaOH
A.6.1成分
蒸馏水
A.6.2制法
1000mL
称取40g氢氧化钠溶于1000mL蒸馏水中，121℃高压灭菌15min。A.71mol/LHCl
A.7.1成分
蒸馏水
A.7.2制法
1000mL
移取浓盐酸90mL，用蒸馏水稀释至1000mL，121℃高压灭菌15min。7
附录B
（规范性附录）
大肠菌群最可能数（MPN）检索表B.1大肠菌群最可能数（MPN）检索表每g（mL）检样中大肠菌群最可能数（MPN）的检索见表B.1。表B.1大肠菌群最可能数（MPN）检索表阳性管数
95%可信限
注1：本表采用3个稀释度[0.1g(mL)、注2：表内所列检样量如改用1g
阳性管数
0.01g(mL)和0.001g(mL))
每个稀释度接种3管。
GB4789.3—2010
95%可信限
(mL)、0.1g(mL)和0.01g(mL)时，表内数字应相应降低10倍：如改用0.01
g(mL)、0.001g(mL)、0.0001g(mL)时则表内数字应相应增高10倍，其余类推8
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