【地方标准(DB)】 蛋禽H5亚型禽流感免疫抗体卵黄检测技术规程

ICS11.220
河北省地方标准
DB13/T946—2008
蛋禽H5亚型禽流感免疫抗体
卵黄检测技术规程
2008-03-28发布
河北省质量技术监督局
2008-04.-12实施
水标雅由河北省畜牧医局提出。前言
本标准起草单位：河北省动物疫病预防控制中心、河北省畜牧兽医研究所。DB13/T946-2008
本标准主要起草人：郑文波、白玉坤、犸雪领、韩庆安、孟艳、吴秀楼、杨秀女、胡自然、武秋双、刘红、许玉静、郑丽、李志民、李同山、张绍军、刘乃强。1范围
蛋禽H5亚型禽流感免疫抗体
卵黄检测技术规程
DB13/T 946—2008
本标准规定了蛋愈H5亚型禽流感免疫抗体卵黄检测技术中的样本采集、试验准备、试验方法、果判定等操作方法：
本标准适用于用卵黄进行蛋禽H5业型禽流感灭活疫苗免疫抗体检测。2 规范性引用文件
下列文件中的条款通过本标准的引用而成为木标难的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用丁本标推，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可以使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GB/T18936高致病性禽流感诊断技术3术语和定义
下列术语和定义适用于本标准。3.1
已经产蛋的含类。
经过肖接稀释或氯萃最制备好的、用于检测的样品。3.3
血凝抑制试验中，同一检样在反应板上出现的前，后孔凝集抑制而中问孔凝集的现象。4样本采集
采集蛋禽免疫接种H5亚型禽流感灭活疫菌21d后所产的新鲜离。5试验准备
5.1材料准备
5.1.1仪器设备
96孔90V型微反应板、微量移液器、滴头、微量振荡器、离心机、液体快速混合器、容量瓶。5.1.2试剂
a）葡萄糖、柠機酸钠、柠檬酸、氮化钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、氢氧化钠、盐酸等。b)禽流感病毒 H5 亚型HI 抗原、离流感病毒 H5 亚型阴性血清和阴性血清。5.2试液配制
5.2.1阿氏（Alsevers】液配制
称取葡萄糖2.05g、柠檬酸钠0.8g、柠檬酸0.055g、氯化钠0.42g：用适量蒸馏水淬解后，移人1(Uml容量瓶中，定溶。用0.0lmol/L氢氧化钠或0.01 mulL盐酸调pH值至6.1，69kPa高压灭菌15min，1
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4%保存备用。
5.2.21%鸡红细胞悬液配制
采集至少三只SPF公鸡或无离流感和新城疫等抗体的健康公鸡的液与等体积阿氏液混合，用pH7.20.01mol/LPBS洗涤3次，每次均以1000r/min离心10min，洗涤后用PBS配成1%（V/V）红细胞悬液，4%℃保存备用。
5.2.30.01 mol/L PBS 试液
a）称取镂酸氢二钠2.74g，磷酸二氢钠0.79g用适量蒸馏水溶解后，移人100mL容量瓶中，定浴。
b）量取上述溶液40ml，加人氯化钠8.5g溶解后，移人1000ml.容量瓶中，定溶。c）用0.01mol/L氢氧化钠或0.0lmol/L盐酸调pll值至7.2，商压灭菌备用。5.3检样制备
5.3.1卵黄直接稀释
在样品管中加人0.5 mlPBS，再吸取 0.5ml 卵黄做1:1稀释，混匀制成卵黄检样备用。5.3.2卵黄氧仿萃取
取5.3.1制备好的黄检样0.4ml加人等量氯仿，迟速用液体快速混合器充分振荡混匀，室温静置30 min，3000r/min离心5min，敢上湾液备用。6试验方法
6.1抗原血凝效价测定(HA试验，微量法)操作方法按CB/T18936执行。
6.2 血凝抑制 [HI} 试验 (微量法]6.2.1卵黄直接稀释测定法
操作方法按CB/T18936执行。用5.3.1中制备的卵黄检样代替血清进行检测。检测时设标准阴性血清和阴性血清对照。
6.2.2卵黄氧仿萃取测定法bzxZ.net
6.2.2.1适用范围
在黄直接稀释测定法检测出现“跳管”或测不出抗体时，采用黄氯仿萃取法捡测，6.2.2.2方法
操作方法按 GB/T 18936执行。用5.3.2中制备的检样代替血清进行检测。检测时设标准阳性血L消和阴性血清对照。
7结果判定
7.1试验结果成立条件
只有阴性对照孔血清滴度不大于2\，阳性对照孔血清误差不超过1个滴度，试验结果才有效。7.2HI滴度的计算方法
以完全抑制4 个HAU 抗原的样本最高稀释倍数作为 HI滴度。样本制备过程中卵黄的稀释倍数和加人氯仿量都计入该样本的稀释倍数。7.3判定方法
7.3.1卵黄直接稀释测定法结果判定将“检样制备”过程中样本的稀释倍数计人终点滴度判定，即：微量反应板上血凝抑制的终点滴度加一个滴度为该样本的HI抗体效价（终点滴度为零时则不再加）。举例：微量反应板上血凝抑制的终点滴度是27，则该样本HI抗体效价为2°，7.3.2卵黄氯仿萃取测定法结果判定2
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将“检样制备”过程中样本的稀释倍数计人终点滴度判定，即：微量反应板上血凝抑制的终点滴度加两个滴度为该样本的印I抗体效价（终点滴度为零时则不再加）。举例：微盘反应板上血凝抑制的终点滴度是2°，则该样本I抗体效价为2°8免症抗体合格判定
8.1个体合格判定
样本HI抗体效价大于等于2为免疫合格。群体合格判定
免疫合格样本数占检测总样本数70%（以上（包括70%）判为群体合格。3
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