【国家标准(GB)】 饲用植酸酶活性的测定 分光光度法

ICS65.120
中华人民共和国国家标准
GB/T18634—2009
代替GB/T18634-—2002wwW.bzxz.Net
饲用植酸酶活性的测定
分光光度法
Determination of feed phytase activity-Spectrophotometric method
资料专用章
2009-05-26发布
中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局数码防伪
中国国家标准化管理委员会
2009-10-01实施
本标准代替GB/T18634—2002(饲用植酸酶活性的测定本标准与GB/T18634-2002相比主要变化如下：缩小了方法的适用范围；
改变了方法的最低定量限；
改变了缓冲溶液的配制方法；
细化了测定过程中的操作步骤；删除了相对法；
分光光度法》
扩大了添加植酸酶的配合饲料样品两次试验的允许差，相对偏差≤15%。本标准附录A为资料性附录。
本标准由全国饲料工业标准化技术委员会提出并归口。GB/T18634—2009
本标准负责起草单位：中国农业科学院农业质量标准与检测技术研究所[国家饲料质量监督检验中心（北京），广东溢多利生物科技股份有限公司，武汉新华扬生物有限公司。本标准主要起草人：马东霞、詹志春、史宝军、苏晓鸥、詹连生、梁雪霞、张苏本标准所代替标准的历次版本发布情况为：GB/T18634—2002。
httn：//wwwfoodmate1范围
饲用植酸酶活性的测定
分光光度法
本标准规定了以分光光度法测定饲用植酸酶的活性。GB/T18634—2009
本标准适用手作为饲料添加剂使用的植酸酶产品，也适用于添加有植酸酶的配合饲料。方法最低定量限为130U/kg
2规范性引用文件
下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括斯误的内容）或修订版均不适用本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GB/T14699.1饲料采样
3术语和定义
下列术语和定义适用于本标准。3.1
植酸酶活性phytaseactivity
在温度37C、pH5.50条件下，每分钟从浓度为5.0mmol/L植酸钠溶液中释放1μmol无机磷，即为一个植酸酶活性单位，以U表示。4原理
植酸酶在一定温度和pH条件下，将底物植酸钠水解，生成正磷酸和肌醇衔生物。在酸性溶液中，能与钥酸锻生成黄色的复合物，可于波长415nm下进行比色测。5试剂和材料
除非另有说明，在分析中仅使用确认为分析纯的试剂和蒸馏水或去离子水或相当纯度的水。清洗试验用器血不要用含磷清洗剂。5.1磷酸二氢钾(KH,PO,):基准物。5.2乙酸缓冲液（1），c（CH.COONa）=0.25mol/L：称取20.52g无水乙酸钠手1000mL烧杯中，加900mL水搅拌溶解，用冰乙酸调节pH至5.50±0.01，再转移至1000mL容量瓶中，并用蒸馅水定容至刻度。室温下存放2个月内有效。5.3乙酸缓冲液（2）.c（CHCOONa）=0.25mo1/L：称取20.52g无水乙酸钠，0.5g曲拉通X-100（TritonX-100）0.5g牛血清白蛋白（BSA）于1Q00mL烧杯中，加人900mL水搅拌溶解，用冰乙酸调节pH至5.50土0.01，再转移至1000mL容量瓶中，并用蒸馏水定容至刻度。室温下存放2个月内有效。
5.4底物溶液，c(CH.OzPNa）=7.5mmol/L：称取0.69g植酸钠（CHOzP.Na，相对分子质量为923.8，纯度为95%）.精确至0.1mg，置于100mL烧杯中，用约80ml乙酸缓冲液（5.2）溶解，用冰乙酸调节pH至5.50士0.01，转移至100mL容量瓶中，并用乙酸缓冲液（5.2）定容至刻度，现用现配1
GB/T18634—2009
（实际反应液中的最终浓度为5.0mmol/1）。5.5硝酸济液：1+2水济液。
5.6钼酸铵溶液，100g/L：称取10g钼酸铵L（NH.Mo,O4H0|手50mL烧杯中加水溶解，必要时可微加热，再转移至100ml容量瓶中，加人1.0ml.氨水（25%）用水定容至刻度。5.7偏钒酸铵溶液，2.35g/L：称取0.235g偏钒酸铵（NH,VO,）于50mL烧杯中，加人2mL硝酸浴液（5.5）及少量水，并用玻璃棒研磨溶解，再转移至100mL棕色容量瓶中，用水定容至刻度。避光条件下保存一周内有效。
5.8酶解反应终止及显色液：移取2份硝酸溶液（5.5），1份钼酸铵溶液（5.6），1份偏钒酸铵溶液（5.7)混合后使用，现用现配。
仪器和设备
实验室常用仪器设备及
分析天平：感量0.1
恒温水浴：37℃60g
分光光度计：有
磁力搅拌器。
涡流式混合器
mm比色血，可在413m下测定吸光度·
酸度计：pH精确至o.01。
离心机：转速
超声波溶解器
回旅式振药装
试样制备
固体样品
000r/min以上。
按GB/T14699的规定进行采样，选取有代表性样品，用四分法将试样缩分至10g，植酸酶产品不需粉碎，配合何料需粉通过0.45mm标准筛，装人密封容器，防止试样成分变化7.2液体样品
8测定步骤
8.1标准曲线
进行采样，选取有代表性样品用前摇包准确称取0.6804g在105C烘至恒重的基准解酸氢钾（5.1）于100mL容量瓶中，用乙酸缓冲液（5.2）溶解，并定容至刻度，浓度为50.0mmo1/L按表1的比例用乙酸缓冲液（5.3）稀释成不同浓度，与待测试样一起反应测定。以无机磷的量为横坐标，吸光值为纵坐标，列出直线回归方程（一α十hr)。
表1标准稀释比例
标准溶液序号
稀释量/mL
H伴网httn://uwfoodmater
浓度/(μmol/mL）
8.2试样溶液的制备
8.2.1酶制剂样品中酶的提取
GB/T18634-—2009
参照附录A中建议的称样量称取植酸酶试样两份.精确至0.0001g，置于100mL容量瓶中，加入乙酸缓冲液（5.3）摇勺并定容至刻度。放人一个磁力棒，在磁力搅拌器（6.4）上高速搅拌30min。或在超声波溶解器（6.8）上超声溶解15min，再放人回旋式振荡器（6.9）中振荡30min。8.2.2加酶饲料样品中酶的提取
称取添加植酸酶的饲料试样两份，精确至0.0001g，置于200mL刻度锥形瓶中，加人乙酸缓冲液（5.32100.0mL在超南波溶解器（6.8）上超声游解15min，再放人回旋式振荡器（6.9）中振荡30min，所有提取后的试样必要时在离心机（6.7）上以4000/mm高心10min：分取不同体积的上清液用乙酸缓冲液（5.3）稀释，使试样液的浓度保持在04U/mL左右，售反应，建议在测定样品时附加
83反应
取10mL试管按
已知活性的植酸酶参考样，使于检验整个操作过程是否有偏差。JP
而应顺序进行操作，标准空白加入0.2m/乙酸级冲液（6.3)。在反应过程中，从加人底物溶液（，开始，向每支试管中加人试剂的时间间隔要解30min
反应步骤及话
容液用量见表2。
表2反应
步骤及试剂、溶液用量
1.加乙酸缓冲液
2.加人待反应液
1水浴（6.2)中
热5min
7.水浴（6.2)中37
8.依次加入终止及显
总体积
8.4样品测定
样品、标准
致，在恒温水浴（6.2)中37水
样品空白
4ml第二步）
L(第一步）
反应后的试样在室温下静置10min，如出现混油需在离心机（67上以4000r/min离心10min，上清液以标准曲线的空白调零，在分光光度计（6.3）415nm波长处测定试样空白（A）和试样溶液（A）的吸光值，A一A。为实测吸光值。用直线回归方程计算相酸酶的活性。9结果计算和表示
9.1结果计算
试样中植酸酶活性以X表示，单位为酶活性单位每克（U/g）或酶活性单位每毫升（U/mL），按式(1)计算：
武中：
试样中植酸酶的活性，单位为酶活性单位每克（U/g）或酶活性单位每毫升（U/mL）；http://foodmate.net（)
GB/T186342009
根据实际样液的吸光值由直线回归方程计算出的无机磷的量，单位为微摩尔（umoD酶解反应时间，单位为分钟（min）;n
试样的稀释倍数；
试样的量，单位为克(g)或毫升(nL)。9.2结果表示
两个平行试样的测定结果用算术平均值表示，酶制剂样品保留整数，加酶饲料样品保留三位有效数字。
9.3重复性
同一试样两个平行测定值的相对偏差，植酸海产品不大于8为，添加植酸酶的各种何料样品不大于15%。
Hk whttn:fumfoodme
附录A
（资料性附录）
建议称样量
根据样品植酸酶活性的不同，建议称样量见表A.1.表A.1
植酸酶活性/B:000以上
1:000~5000
500~1000
建议称样量
http：//foodmate.net称样量/g
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打印日期：2009年9月1日
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饲用植酸酶活性的测定
分光光度法
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中国标准出版社出版发行
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中国标准出版社秦皇高印刷厂印刷各地新华书店经销
开本880×12301/16
2009年8月第一版
印张0.75
字数9千字
2009年8月第一次印刷
书号：155066·1-38459定价16.00元由本社发行中心调换
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