【国家标准(GB)】 保健食品中维生素B12的测定

ICS67.040
中华人民共和国国家标准
GB/T5009.217-—2008
保健食品中维生素B1?的测定
Delermination of vitamin B2 in health foods2008-12-03发布
数码防伪
中华人民共和国卫生部
中国国家标准化管理委员会
2009-03-01实施
本标准由中华人民共和国卫生部提出并归口。本标准起草单位：中国疾病预防挖制中心营养与食品安全所。本标准主要起草人：杨大进,善杰。http://foodmate.netGB/T 5009.217--2008
1范围
保健食品中维生素B12的测定
本标推规笼了保健食品中维生紫B的测定方法，GB/T 5009.217-2008
本标准适用于片剂、胶囊、粉剂、功能性饮料类型保健食品中维生素B12的测定。本方法使用固相苯取法处理样品时，取样量为2.0，方法的检出限为1.0μg/g。当应用免疫亲利法处理样品时，片剂、胶囊、粉剂取样量为2.0多，力法的检出限为0.05g/g：功能性饮料取样量为20mL.方法的检出限为3.0/L。
2原理
采用固相举圾法或免疫亲和色谱法对试样提吸液中的维牛素B：进行富集并去除部分杂质，高效液相色谱分析。
3试剂
除非分有规定，本标准中所用试剂均为分析纯，实验用水均为实验案：-级用水，电导率（25℃）为0. 0l ms/m.
3.1乙腊（C.I.N)：色谱纯
甲醇（CH,QO)：优级纯。
乙醇(C2H,O).
四丁基氮化铵(CisH3NCI)。
5%四丁基氟化铵（CleHgNCI)溶液：称取5.0g四丁基氯化铵，加水溶解并稀释至100mL。三氯中烷（CHCL）。
三氟乙酸(C,F,O,H)
3.8柠檬酸（C,H,O,）
3.9磷酸二氢钾(KH,PO)。
3.10氢氧化钠(NaOH),
磷酸缓冲液（pH6.5)：取磷酸二氢钾0.68g，加0.1mol/L氧氙化钠溶液15.2tmL，再用水稀牟100mL
3.12维生素Bz标准品：纯度≥99%。3.135%乙睛：量取50mL乙腈，用水稀释定容牟1000mL。3.1425%乙睛：量取250ml.乙睛，用水稀释定容至1(000mL3.15维生素Bl2标准储备液：称收维生素B标推品10mg（精确至0.1Ⅱg），用5%乙醇溶解，并定容至10 mI.棕色容量瓶中，混勾，得到维牛索Biz的标准储备液。冷藏保存。3.16维生素Bz标准中间液：吸取1ⅡL储备液至25mL棕色容量瓶中，用水稀释得到维牛素Bz的标准中间液。冷藏保存，
3.17维生素Bz标准系列：分别吸取0.05mL.0.10mL、0.50mL、1.00mL、2.00ml.、5.001uL的标准中间液于10mL棕色容量瓶中，用水稀释得到维生素B:标准溶液系列。4仪器和设备
4.1高效液相色谱仪，附紫外检测器。1
GB/T5009.217--2008
4.2超声波清洗器。
4.3 离心机:1 000 1/min
4.4固相萃取柱：N-乙烯基吡略烷酮和二乙烯基苯亲水亲脂平衡型固相萃取柱（GOmg.3tmL）。4.5免疫亲和净化柱：维生素B1免疫亲和净化柱（EASI-EXTRACT?VITAMINEB2）!5分析步骤
5.1固相萃取法（前处理方法一)操作步骤5.1.1试样处理
将20粒片剂、胶囊试样粉碎或混勺；粉剂试样取5包～10包充分混勾。5.1.2提取
称坡试样4g～10g（相当于含维生素B124μg左右，精确至0.001g）于50mL离心管中，加10mL~-15ml.水，混勾，将其置于超声波清洗器中，超声提取约10min后以4000r/min离心5ini1。用吸管吸取上清液置于另一个50ml.离心管中。对残渣按上述步骤每次加入约10ml.水，重复提取两次，合并提液子5GmL离心管中。5.1.3净化
向提取液中加人5%四丁基氯化铵溶液1mL、三氮甲烧约20mI.,使用旋混勾器充分混匀，于离心机中以10001/min离心3min。将水层转人蒸发m中，置水浴锅上加热蒸发至于。残渣用乙溶解，转移至离心管中，超声落解，离心，吸上消液于蒸发血中。再重复提取两次，合并提取液于蒸发函中，蒸1乙醇,试样用5 mL 5%乙腈溶定量转移到试管中,待上固相萃取柱。5.1.4固相萃取
固相萃取柱先用3ml.甲醇进行活化，再用3ml水对固相萃取柱进行平衡，速度为1滴/s。将E述处理过的适展试样加到固相萃取柱上。上样后，用5mL5%乙睛溶液作为洗脱溶剂将干扰物质从固相萃取柱上淋洗下来，最后用25%乙腈溶液将维生素Btz洗脱下米，收集洗脱液0.5mL。5.2免疫亲和法（前处理方法二)操作步骤5.2.1试样处理
碳酸型功能性饮料:取 15U mL样液于超声波中脱气 10 min,待用。果粒或果汁型功能性饮料：用1mo1/L氢氧化钠调pH至7.0，置离心机中以转速4000/min离心10 min,过滤,滤被特用。
片剂、胶囊、粉剂：取20粒片剂、胶囊试样粉碎或混勾。粉剂试样取5包～10包充分混勾。称取试样10g~50 g(相当于维牛素 Bl的量为25μg~-2500μg，精确垒 0.001g)于250mL容量瓶中，期入100mL水，播混匀，将其置于超声波清洗器中，超声提取约15min后用水定穿，稀释样品溶液的浓度到样品中维生素B12的含量为25\g/mL。如样品溶液的pH在7.0以上，用柠檬酸调节PH在1.5～7.0之间；如样品溶液的pH在1.5以下，则应用磷酸缓冲液代替水作为提取液并重复上面步骤。
5.2.2富集，净化
维生素B1免疫亲和净化柱先用10mL水淋洗小柱中未键合的化合物，吸圾20mL(5.2.1)提取液上样到净化柱上，冉用3mL中醇洗脱维生素3至蒸发血中，整个过程速度约为1滴/s。于60℃～70℃水浴中蒸干溶剂，用1ml.0.025%的三氟乙酸溶液溶解，落液过0.45μm水系滤膜，待高效液相色谱用。
5.3液相色谱参考分析条件
5.3.1色谱柱:Cg（4.6 mm×250 mm,5μm）反相色谱样。1）给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不表示对该产品的认可。如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效的产品。
5.3.2流动相：采用梯度洗脱方式，见表1。表1流动相梯度洗脱表
19~-20
20--30
流速：1mL/min.
5.3.4检测波长：361nn。
5.3.5柱温：室温。
5.4测定
A:0.025%二氟乙酸(pH-2.6)
GB/T5009.217—2008
吸攻20标准溶液和试样溶液注人高效液相色谱仪中，以保留时间定性，用标准曲线法进行测定。
6结果计算
按式(1)计算试样中维生素B2的含量。X=Axf
式中：
试样中维生素B的含量，单位为微克每克或微克每毫（ug/g或/nL)；从标准曲线[查得的含最，单位为微克(ug)；A
f——试样稀释假数；
m——试样的取样量，单位为克或毫升(g或mL)。计算结果保留两位有效数字。www.bzxz.net
精密度
在重复性条件下获得的两次独立定结果的绝对差值不得超过算术乎均值的20%8色谱图
维生素Bz标准色谱图见图1。
0. 006 号
维生素B12标准色谱图
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（1）
GB/T 5009.217-2008
中华人民共和
国家标准
保健食品中维生素 B:2的测定
GB/T 5009.217—2008
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