【国家标准(GB)】 草菇菌种

IS 65. 020. 99
中华人民共利国国家标准
GB/T23599—2009
草菇菌种
Pure cnlture of strawmushroom2009-04-23 发布
中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中国国家标准花管理委员会
2009-09-01实施
本标准的附录A、附录B.附录C和附录I)均为规范性附录。本标准由中华全国供销合作总社提出并归口。GB/T 23599—2009
本标准起草单位：广东省食用菌行业协会、广东省微生物研究所、广东粤微食用菌技术有限公司、农业部微生物肥料和食用菌菌种质量监督检验测试中心。本标准主要起草人：杨小兵、胡惠萍、吴清平、朱少琼、李森柱、黄龙花、黄晨阳、廖世煌、张··帆、张金霞。
http://foodmate.net1范圈
草菇菌种
GB/T 23599-—2009
本标推规定了草菇(Voluariella wvolwucea）菌种的相关术语和定义、质量要求、试验方法、检验规则及标签、标志、包装、运输、贮存的要求。本标准适用于草菇菌种的生产，流通和使用。2规范性引用文件
下列文件中的条款通过本标推的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用丁本标准，然而，鼓励根据本标推达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用本标谁。GB/T191包装储运图示标志（GB/T1912008,IS)780：1997,MOD）GB/T4789.28-2003食品卫生微生物学检验染色法.培养基和试剂GB/T12728—2006食用菌术语
NY/T528—2002食用菌菌种生产技术规程术语和定义
GB/T127282006确立的以及下列术语和定义适用于本标准3.1
拮抗现象antagunism
具有不同遗传基因的菌落间产生不生长区带或形成不同形式线状边缘的现象。3.2
角变sector
因菌丝体局部变异或感染病毒而导致菌丝变细、生长缓慢、菌丝体表面特征成角状异常的现象。3.3
高温抑制线
high-temperatured line
食用菌菌种在尘产过程中受高温的不良影响，培养物出现的状发黄、发暗或菌丝变稀羽的现象。
4质量要求
4.1母种
4.1.1容器规格
按NY/T5282002中4.7.1.1的规定执行。4.1.2感官要求
应符合表1的规定。
GB/T23599—2009
梳塞或硅胶塞
培养基藩人蛋
面长度
接种块大小(接种量)
菌丝生长量
菌丝体特征
菌种外观
幽丝体表面
菌丝分泌物
菌落边缘
杂菌菌落
斜面背面外观
4.1.3微生物学要求
应符合表2的规定。
菌丝生长状态
细菌和霉菌
4.1.4菌丝生长速度
表1母种感官要求
完整，无损
千燥、洁净、松紧适度，能满足透气和滤菌要求试管总容积的四分之一至H分之
顶端距棉塞或硅胶塞 40 tntn-~50 mm(3 m-~5 mm)×(3 mm~5 n)
长斜面
淡白至黄白色、半透明、肝健、丰满、睦力强、气生菌轮旺盛、菌种表面允许有少量红褐色的厚垣孢子舒、无角变
培养基不干缩,颜色均勾、无暗艇、无色素有草菇菌种特有的清香味,无酸、臭、存等异味表2母种微生物学要求
粗壮、卡满，显微镜下观察，有直径=8 的粗壮菌丝，菌丝线形，分枝均匀，是直角或近于直角无
在 PDA(马铃萼葡萄糖琼脂)培养基上,在黑暗、逅温(32 ℃土1 ℃C)条件下,菌丝长满斜面的时间火3 da d.
4.1.5母种栽培性状
供种单位所供母种需经出菇试验确认农艺性状和商品性状等种性合格后，方可用于扩大繁殖或出售。产量性状在正常条件下,以来用附录13中提供的裁培培养基为例,生物学效率应不低于20%。4. 1.6菌丝可溶性蛋白电泳图谱特征电泳图谱在Rf=0.75(Rf 为电泳条指的相对延移率)处只染色根深的蛋白情，4.1.7ITS(内部转录间隔区)序列特征供试菌株的ITS序列与草菇V23的ITS序列进行比对，相似性应达98%以上。4.2原种
4.2.1容器规格
使片650ml,--750ml.且耐126高温的无色或近无色的玻璃菌种瓶，或850ml.耐125℃高温片色卡透明的塑料案种瓶,或(13 cm～15 cm)×(26cm~～28 cm)耐 126 ℃高温的聚内烯塑料袋,各类容器都应使用棉塞或能满足滤菌和透气要求的尤棉塑料盖，4.2.2感官要求
应符合表3的规定，
棉塞或无棉塞塑料盖
培养基表面距瓶（袋）口距离
接种量（每支母种接原种数，接种物大小）菌丝生长垦
菌丝体特征
培养物表面菌丝体
菌种外观
培养基及菌丝体
培养物表面分泌物
菌菌落
拮抗现象
子实体原基
4.2.3微生物学要求
应符合表2的规定。
4.2. 4菌丝生长速度
表 3 原种感官要求
完整，无损
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十燥、洁净、松紧适度，能满足透气和滤菌要求50 mm=5 mm
4 瓶(袋)~6 瓶(袋),2(12 mm×15 mm)长满容器
菌丝显淡白或灰白色，生长旺健、饱满，菌种表面允许有少量红褐色的厚垣孢子
无角变、无高温抑制线
紧贴瓶壁，无干缩
有草菇菌种特有的清香味，无酸、臭、霉等异味在适宜培养基上，在适温（32℃±1℃）条件下，菌丝长满容器的时间为7d～12l4.3栽培种
4.3.1容器规格
按照 4. 2.1的规定执行。
4.3.2感官要求
应符合表 4 的规定。
表4裁培种感官要求
棉塞或无棉塞塑料盖
培养基上表面距瓶(袋)口的距离接种量L每矩(袋)原种接裁种数」菌丝生长盘
菌丝体特征
不同部位菌效体
菌种外观
培养基及菌丝体
培养物裁面分秘物
杂菌菌落
拮抗现象
了实体原基
合品球伴网httn
完整，无损
干燃、洁净、松紧适度，满足透气和滤菌要求50 mm±5 mm
3D瓶（袋）～50瓶（袋）
长满容器
菌丝显淡白或灰白色，生长旺健、饱满，菌种表面充许有少量红褐色的厚垣抱子
生长齐整，色泽一致，无角变，无高温抑制线紧贴瓶(袋)壁、无干缩
有草菇菌种特有的消清香味，无酸、良、而等异味3
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4.3.3微生物学要求
应符合表 2 的规定。
4.3.4菌丝生长速度
在适宜培养基[:,在黑暗、适温(32 ℃士1 ℃)条件下，菌丝长满穿器的时间为 7 d~12 d。5试验方法
5.1感官检验
按表5逐项进行。
表 5 感官要求检验方法
检验项日
硅胶塞、尤棉塑料
母种培养基灌入量
母种斜面长度
母种斜面背面外观
5.2微生物学检验
检验方法
肉眼观察
肉眼观察
肉眼观察
接种量
检验项目
征种、原种
栽培种
培养基上表面距瓶(袋）
口的距离
菌种外观各项
（杂菌菌落除外）
杂菌菡落
检验方法
肉服观察、测量
检查生产记录
肉眼观察
肉眼观察
肉眼观察，必要时用5倍
放大镜观察
5.2.1表2中菌丝生长状态用放人倍数不低于10×40的光学显微镜对培养物的水过片进行观察，每一检样应观察不少于50个视野。5.2.2细菌检验：取少量疑有细菌污染的培养物或菌块，按无菌操作接种于CB/T4789.282003中4.8规定的营养肉汤培养液中，36℃～38℃振荡培养1d，观察培养液是否混沙。培养液混浊，为有细菌污染：培养液澄清，为无细菌污染。5.2.3需菌检验：取少量疑有霉菌污染的培养物或菌块.按无荫操作按种子PDA培养基（见A.1.1）中，25℃~28℃培养3d~4d，出现白色以外色泽的菌落或非草菇菌丝形态菌落的，或有只味者为霉菌污染物，必要时进行水挝片镜检。5.3菌丝生长速度
5.3.1母种：按A.1.1或A.1.2的配方,32℃士1℃培养，计算长满试管所需大数。5.3.2原种和裁培种：按A.2.1、A.2.2的配方任选其一，在32℃土1℃培养，计算长满所需天数。5.4菌丝可溶性蛋白电泳方法
供试菌株先经3次维代培养，按附录C规定的PDY(马铃薯加富）液体培养基，32℃黑暗浅层培养10d。取1层菌丝体于冰浴中匀浆，再于13000r/min，离心10min，上清液作为样品，采用聚丙酰胺凝胶电泳，Tris-H氨酸缓冲系统，PHI8.9，凝胶浓度8%。使用Mini-PRCTEANⅡ板式电泳槽，点样最20mL，乎冰浴中以10mA/块电泳2h。用考马斯亮蓝R250染色（0.1%考马斯亮蓝的7%乙酸溶），用含7%乙酸的20%甲醇溶液固定脱色。5.5ITS序列分析方法
按照附录D进行操作。
5.6母种农艺性状和商品性状
将被检母种制成原种、裁培种。按附录B规定的培养基配方，采用床架式栽培方法，制作15m培养料，料厚度为8 cm~10cm。接种后分三组（每组5m)进行常规替理，根据表 6所列项，做好裁培4
品成伴网ht
GB/T23599—2009
记录，统计检验结果。同时将该母种的出发菌株设为对照，做同样处理。对比二者的检验结果，以时间计的检验项目中，被检母种的任何一项时间较对照菌株推迟3d以上（含3d)者，为不合格：产量显著低丁对照菌株者，为不合格;菇体外观形态与对照明显不同或畸形者，为不合格。表6母种栽培中农艺性状和商品形状检验记录检验项目
母种长满所需时间/d
菌丝长满培养基料面所需时问/d出第一潮菇所需时间/al
第-潮菇生物学效率/兆
平均单产/(kg/m2)
5.7留样
检验结果
枪验项目
原种长满所需时间/d
总生物学效率/%
色译、质地
菇尺寸/mm
检验结果
各级菌种都要解样备查，留样的数量应每个批号菌种3支（瓶、袋），于15℃～20℃下贮存，贮存期卧种为90d.原种为15d,裁培种为15d。6检验规则
6.1抽样
质检部门的抽样应具有代表性：母种按品种、培养条件、接种时间分批编号，源种、裁培种按菌种来源、制种方法和接种时间分批编号，按批随机抽取被检样品。母种、原种，裁培种的抽样最分别为该批菌种量的10%5%、1%。但每批样数量不得少于10支（瓶、袋）；超过100支（瓶、）的，可进行两级抽样。
6.2判定规则
按质量要求进行。检验项目全部符合质量要求时，为合格菌种，其中任何--项不衍合要求，均为不合格菌种。
技术指标全部或部分不符合要求，允许业者整改后巾请复检次，如仍不符合要求，则判此批产品不合格。
7标签、标志、包装、运输、贮存7.1标签、标志
7. 1. 1 产品标签
每支（瓶、袋）菌种应贴有(白有)清晰注明以下内容的标签：a）产品名称（如：草菇母种）)；b）品种名称（如：粤草02)；
c）牛产单位（××菌种厂）；
d）接种期(如:20××、××.××);c）执行标准。
7.1.2包装标签
舞箱（或其他包装单位）菌种应贴有清晰注明以下素的包装标签：a）产品名称，品种名称；
b）厂名厂址,联系电话；
c）出厂日期：
d）保质期、妤存日期、些存条件；c）数量；
CB/T 23599—2009
f）执行标雅，
7.1.3包装运图示
按GB/T191的规定，应注明以下图示标志：a）小心轻放标志；
b）防水、防潮、防冻标志；
）防晒、防高温标志；
d）防止倒置标志；
e）防止重压标志。
7.2包装
7.2.1母种外包装采用木盒或有足够强度的纸盒，内填棉花、碎纸、泡沫塑料等缓冲物。7.2.2原种、栽培种外包装可采用洁净、1燥的塑料箱，编织袋或有足够强度的纸箱，7.3运输
7.3.1不得与有毒物品混装.混运。7.3.2气温在10℃～15℃和35℃以上时，运输时间不得超过2d；气溢在15℃~35℃时，运输时间不得超过1周;气温在10 ℃以下时,应保温15 ℃～35 ℃运输7.3.3运输中应有防震，防晒、防尘、防雨淋、防冻、防杂菌污染的措施，7.4赔存
7.4.1母种在使用或销售前，在15℃~20℃保藏不超过90d。使用前，在20℃～35℃存放不超过48 h.
7.4.2原种和栽培种菌丝长满种袋（瓶）后，应置于消洁、干煤通风（空气相对湿度30%～70%）、避光的案内。在28 ℃～32 ℃贮存不超过5 d,而在15 ℃～20℃贮存不超过15 d6
附录A
（规范性附录）
草菇母种、原种及栽培种常用培养基及其可选配方A.1
莫菇母种常用培养基及其可选配方A, 1. 1 PDA 培养基(1 000 mL)马铃薯（去皮）200g，葡萄糖20g琼脂20g，水1000ml，pH7.5～8A. 1. 2
综合PDA(CPDA)培养基(1000mL)
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马铃薯（去皮）200g，葡葡糖20，磷酸二氢钾2，硫酸镁0.5g，琼脂20g，维生素B,20μg：水1 000 mL pI17, 5~8.
A,2草菇原种和栽培种常用培养基及其可选配方A.2.1颗粒培养基
小麦.谷子、米或高粱等粮食颗粒99.5%，生石灰1%，含水量50%12%，pF18~9A,2.2棉籽壳培养基
棉籽壳80%，麦麸15%，牛石灰5%，含水量60%士2%，pH8-~9。7
http://foodma
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粘籽棉培养基
附录B
(规范性附录）
草菇栽培常用培养基
粘籽棉95%，用5%生不灰水浸泡，浙去余水后使用，8
http://foodmate.netPDY 培养基
（规范性附录）
菌丝可溶性蛋白电泳方法中PDY培养基配方Dilca 马铃薯-葡糖粉 21 g,酵母粉 2g,蒸馏水 1 000 mLhttp://foodmate.netGB/T23599—2009
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I).1检测流程
附录D
（规范性附录）www.bzxz.net
草菇菌种 ITS 序列分析法
待测样品-液体培养基增菌或待测菌株菌丝DNA提取→PCR扩增→序列测定→比对分析·结果判定。
D.2材料与方法
D.2.1菌体培养
待测菌种增菌液体培养基CYM.蛋白陈2g，酵母育2g，葡萄糖20.2g，硫酸镁（MgSO4：7H.U)0.5g,磷酸氢二钾(K;HPO4)1g,磷酸二氨钾(KHzPO,)1g.纯水1000 tml.,pH7.5~8.0培养基分装至三角瓶后火菌，冷却，接种，置于30℃130r/min摇床培养3d，菌丝真空抽滤，光菌水洗涤，低温下燥，一20℃保存备用。D.2.2DNA提取和纯化
CTAl(cetyltrimcthylamtmoniumbramide)法：a）2倍CTAB提取液在65℃水浴锅中预热，b）适量(0.1g-1g)菌丝体置于研钵中，用已灭菌的有英沙或液氮中研磨，同时加人少量聚乙烯基吡咯烷酮(PVP)(防氧化)，将菌丝体充分研磨成粉末状。c）样品转入1.5mL离心管中，管内先加入600μL2倍CTAB提取液在65℃水浴锅中预热（用少量提取液洗下研钵上残留的粉末样品，轻轻混,65℃水浴30nin~60min，其间每隔10 min轻轻摇动。
d）冷却2min后，加人等体积（约600uL）的酚-=氯甲烷-异戊醇(25：24：1），充分摇动混匀。e）10000r/min，离心10min，取上清液移入另新管，重复步骤d)用三氯甲统-异戊醇（21：1)再抽提离心一次。同时将2/3体积的异丙醇（或2倍体积的光水乙醇）预冷。两次抽提后的L清液转入新离心管，加入2/3体积的预冷异丙醇（或2倍体积的预冷无水乙f
醇），再加入约1/10体积的乙酸钠（约30μL～50μ1），缓慢翻转混勾，沉淀[NA。g）13000r/min，离心15min，去上：清液。70%酒精（400μL）漂洗沉淀2次（快速翻转振荡几分钟），8000/min，离心5min，去上清液，沉淀用纸巾吸剩余乙醇，白然晾干或低温烘干（电风筒吹干）。
h）加1倍TE缓冲液（Tris10mmol/L+EDTA1mmol/1)溶解（约50μL)。—20℃保存备用。D.2.3PCR扩增
采用真菌核糖体基因间隔区通用引物对ITS1/ITSA(ITS1:TCCGTAGGTGAACCTGCGGITSA：TCCTCCGCTTATTGAIATGC)进行PCR扩增反应体系：PCRmix25μL，DNA模板5μL，双蒸水12μL，通用引物（10uM）各4μL，总体积50l.。
反应条件：94℃预变性5min；94℃1min*55℃1min→72℃1min，30个循环，72℃10min完成延伸。
D.2.4序列测定
PCR扩增产物用1.0%琼脂糖电泳检测，布UVP凝胶成像系统下成像观察条带情况，并保存图像。PCR扩增产物回收纯化后，以PCR引物为测序引物，分别从正反链双向测序，该操作由牛物公司完成。10

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