【国家标准(GB)】 牛奶和奶粉中玉米赤霉醇、玉米赤霉酮、己烯雌酚、己烷雌酚、双烯雌酚残留量的测定 液相色谱-串联质谱法

ICS 67.050
中华人民和家标雅
GB/T 22992--2008
牛奶和奶粉中玉米赤霉醇、玉米赤霉酮、已烯雌酚、已烷雌酚、双烯雌酚残留量的测定bzxZ.net
液相色谱串联质谱法
Determination of zearalanoi,zearafanone, diethylstilbcstrol, hexestrol anddienoestrol multi-residues in nilk and rnilk powderLC-MS-MS metod
2008-12-31发布
中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中国国家标准化管理委员会
2009-05-01实施
本标准的附录A,附录B为资料性附录，前
本标山中华人民共和国国家质量监督检验检疫总用提出并归凹GB/'l22992—2008
本标雅起草单位：中华人民共和国案皇岛出人筑检验检疫局、中华人民共和国天津出人境检验检疫篇。
本标准主要起草人;泓、吴延晖、何佳、张骏、张曼、林安湾、庞国芳。1
http：//foodmate.net1范鼠
牛奶和奶粉中玉米赤霉醇、玉米赤霉酮、巴烯雌酚、烷雌酚、双烯雌酚
残留量的测定
液相色谱-串联质谱法
GB/T 229922008
本标雅规定了4奶和奶粉玉米苯霉醇（zearalanol）、下米赤霉酮（zearakanone）、已烯耀酚（diethylstillhestrol）、凹烷雌酚（hexesttul）、双烯雌酚（dicno-cstrol）残留量液相色谱串联质溃测定方法。本标谁用于牛奶和奶粉中玉米赤醇、程米赤霉酮、己烯硼酸、巴烷雌酚.双烯雌酚残留鼠的测定，本标准方法检出限：奶中飞米赤霉醇、玉米赤霉、已烷雄酚、已烯雄酚和双烯雄翻为1.0g/.；奶粉中卡米亦露醇、玉米赤霉酬酮.已烷焰酚已烯雌骑和双烯雌为8.0g/kg：2规范性引用文件
下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标谁的条款，凡是注日期的用文件，其随后所有的修改单（不包括谢误的内容)或修订版均不适用于本标准，然，鼓励根据本标摊达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。儿是不注月期的引用文件，其最新版本适用于本标准GB/T6379.1测量方法与结果的准确度（正确度与精密度）第1部分：总删与定义(GB/T 6379.1—2CC4ISO 5725-1:1994,IDT)GB/T6379.2测量方法与结果的准确度（正确度与精密度）第2部分：确定标准测量方法重复性与现性的蒸本方法(GB/T 6379.2—2004,ISO5725-2:L594,IDT)GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法（GB/TG682--2C08，ISO3696:1987，MOD）3原理
用乙情作为蛋自沉淀剂和提取剂进行捷取，阴离子固相举最逆行冷化，用液树色谱-串联质溃仪测定，内标法定量。
4试剂和材料
除另有说明外所用试剂势为分析纯。4.1水:GB/T6582.—级。
4.2甲醇，色谱纯。
4.3乙睛：色继。
4.4氮水。
4.5中酸.
4.6氢氧化钠。
4.75mal/1.氢氧化钠溶液：称取200氢氧化钠，用蒸馏水定容到！L.4.8淋洗液：氮水-水(1十19）。4.9洗脱液：甲酸甲醇（1119)。4.10激素及代谢物标准物质：玉米赤霉醇（包指α玉米亦霉醇和β-K米赤莓醇，各50%）纯度火下等丁97%，米赤霉酮，纯度大于等于97%；已烯雌酚，纯度大于等乎03%，巴炼雅酸，纯度大了等干品伙伴网h
GB/T 22992-~2008
98%：双烯脏臀，纯度大于等于98%。4.11标准溶液：分别准确称取适量的玉米小霉尊，玉米亦霉酮、己烯雌酚、双烯雌和己烷雌盼标润物质，用甲醇（4.2)制成「mg/nll.标准贮备溶液。再根据需以甲醇配制成不尚浓度的混合标准溶液作方标准工作露液，保存子4冰箱币。4,12内标标推物质：α下米赤露烯醇4氛代，纯度大上等下99%;己烯雌酚-8氛代，纯度天于等手98%
4，月3内标标准辫鞍：滩确称取适最卡米亦烯醇：4氛代和已烯雌酚-8氛代标雄物质，用中尊（4.2)分别配制成1tg/rr:1.标准备辫被。再以用醇稀释成适用涨度的混合内标工作熔液-保存1冰箱中
4.14步质提取：空启详品-除不加人弥推下作溶液（.11)和内标T作溶液（4.13)外，其独操作同7.1.1及7.1.2处理后得到的溶液：4.15我质标1作溶液：将标雅.L作溶液(4.11)及内标二作溶液(4.13)混合后在氮嵌仪中吹干，以基质提取液（4.14)溶解，渴旋30后即为基质标准工作踏液，4.160asisMAX阴离子函柜萃取柱或相当者：60mg3mL4. 17滤膜:0.2μm
5仪器
5.1液相色谱-半联质谱联用仪：配有电喷雾电高源。5.2自动固相获取仪或周相苯取装暨。5.3氮气吹下仪，
5.4涡旋振荡器。
5.5离心机转速人于3500/mim
5.6高速离心机转速大于9 000 r/min.温度码控制在4 ℃。6试举的劑备
6，牛奶
瑕50 班L新解或解冻的4奶混合均匀,35c0 /in离心mit，堰下虞。6.2奶粉
取 12.5乌奶粉于燎林巾,加适量 3；℃~℃水将其慢慢溶孵,转移至 1U0 mT.容量瓶巾,待冷划至窄温，用水定容混匀：取50 mL，以350Gr/min离心5min,取下层。7測定步骤
7.1混合整质标准校准溶液的制备7.1.1祥品量取
L离心符巾,分加人不同量混合标准L作溶液（1.【1),使各被测组分正米赤舞醇、正米赤酮己烧雌瓣、已烯滩酚和双烯雌酚的浓度为 2.5 2g/mL、5.0 ng/inL、10 11g/nL、25 g/mL0 ng/m1.再分别删人适量内标标难I.作落液（4.[),使其浓度均为1Cng/mI在氮吹仪上于40)水浴中恢于，取5个阴性样品,每个样品为5mL,置上,上述离心管中溺旋混合后,加10 mL乙，渴旋混合3min,3500 r/min离心10 min,收上清液于离心管中，再尚样品中证[人5 mlZ臂，同前操作，合并提取液,50 ℃下氮吹牟体积小于 0.1 mL 加水 10 mL,月 5 01/L Ne0H 调节 pH 至 11. 0,4 ℃,1）（asisMAX荫离于固萃取杆思W&icrs公间产品的商品名称，给出这信息为「方便术标准的使者，并不是我示对该产品的认。如其他产品其有相同的效果，则可使这些等效产品。A
9 000 z/mnin离心 5 min,备用。7.1.2提取净化
GB/T 229922008
固相萃取净化条件：先用2ml.甲醇、2mL水将柱子活化，流速均为4mL/min，将7.1.1样品上清液上.流速为1ml./mi，依次用1nL淋洗液（4.8）、0.5ml申醇以3nL/mi的遮度淋洗，通人20 mL空_以4 mE/min的速度吹过Oilsis MAX柱。用1 mL洗脱液(4.9)洗脱，流速为1 mL/min。加人30mL察气以6mL/min的速度吹过QasisM^×柱，收集洗脱液。将洗说液在氮吹仪上于4Cr水浴中欢于，加入1mL流动相，满旋30s溶解。溶液过0.2m滤膜后，液相色谱串联质谱测定。7.2实测样品溶液的制备
取待测样品5tnL于50mL离心管中，期人适量内标标准工作溶液（4.13)，使其最终定容浓度均为10 g/m按7.1.1及7.1.2操作。
7.3空自基质溶液的制备
取阴性样品5mL于50ml.离心管巾，按7.1.1及7.1.2操作。7.4测定条件
7. 4. 1 液相色谱条件
液相色谱条件如下：
色谱柱，zORBAXEclipseSBC,,3.5μm,150mm×4.6mm(内径>或租当各；a
b）桂温;25 ℃；
t）流动相:乙睛-水(7·+-3)
d)）流遠:0.5 ruL/min:
e）进样量：50ml
7.4.2质谱条件
质谱条件如下：
离下化方式：电喷雾电离：
）扫描方式：负离-扫摘：
c）检测方式：多反应监测(MRM)；d）
离子源温度：350°：
赛化气压力:0.C83MPa；
气帘气压力：0.1240MPa；
辅助气1压力0.27GMPa
辅助气2压力：0.2412MIa；
喷雾器电流，5μA；
电喷券电压：—4500V;
定性离子对、定量离了对、避撞能最和去簇电压见表1。k）
表 15 种激素及代谢物的定性离子对、定量离子对、瓣撞能量和去簇电压化合物名称
玉米赤霉孽
玉米赤明
玉米弥廖稀
醇-氛代
定性离子对(m/z)
320. 6/277. 2
321.1/161.0
318.7/160.3
318.7/107.0
322. 9/159. 9
322. 9/130. 1
定量离于对(n1/2)
321.1/277.2
318.7/160.8
322.S/159.0
砸撞能点/V
去嵌电反/V
GB/T 22992—2008
化合勃名称
已烯雌酚
双烯雄黔
已烷雌酚
二烯蹭验-8荒代
定作离了对(m/α)
266.9/251.0
266.97237.1
264.7/249.1
264.7/235.0
269.0/118.9
269.0/134.0
275.0/258.9
275.0/245.0
7.4.3液相色谱-串联质谱测定
7.4.3.1定性测定
裘(续）
耻离子对(n/=)
266.7/251.0
264.7/249.1
269.0/134.0
275.0/258.9
遮能量/V
去载中医/V
每种被测组分选择！个逆离子，2个以上子离了，在相同实验条件下，样品中待测物质和内标物的保留时间之比，也就是相刘保留时间，与混合基质标谁校推溶液中对应的程对架留时闻端差在土2.5为之内；H样品谱图叫各组分定性离子的和对丰度与浓度接近的混合基所标准校准溶波谱图中对应的定性离子约相对丰度进行比较，偏差不超过表2规定的范图，则可判定为样品中存在对应的待测物。表 2定性摘证时相对离子率度的最大允许偏差相对离子幸变 K
分许最大谢染
7.4. 3.2定量测定
20-K- 50
10-K 29
配制系列混合基质标准工作落液（7.1)分别逊梓，绘制标准工作曲线，检查仪器性能，确定线性范国。用色谱数据工作站或选取与样品含量接近含有内标的标谁工作液进行定量。样品浴液中上米亦露婷，玉米赤砸，己懿雌酸、已烷崛酚、双烯璇的响应值应在工作血线范匿内：标准品的液柜食谱-中联质谱色谱图参见附录A中的图A.1。本方法检测牛奶中的激素及代谢物添握浓度及其平均回收率的试验数据参见附录 I3中的表 B. 1 。7.5平行试验
按以上步骤，对同-试摔逃行平行试验测定。7.6空自试验
除不称圾试样外，均按上述步骤同时完成空户试验。8
结果计寞
玉米赤穿醇、米赤酮、已烯雌龄、已烷雌盼、双烯斑酚的测楚按式1)计算x%×
式中：
试样中被测物残留暨，单位为徽克每克（/k）；1000
基质标推工作溶液被测物的浓度，单位为纳克每毫升（ng/mL)；试样溶液中被测物的色谱峰面积；基质标准工作溶液中被测物的潜峰面积；As--
试样溶液中内标物的浓度，单位为纳克每毫升（ng/IrL）：基质标准工作溶液中内标物的浓度，单位为纳克毫升（/ml.)：合品伙伴网httn
基质标准工作溶液中内标物的色谱峰面积；A.—试样落液中内标物的位谱锋面积：V—.样液最定容体积，单位为案升（mL）；试样溶液所代表试祥的质量，单位为克(g）。GB/T 229922008
计算结果应扣除空白值：玉米激霉醇和己烯雌盼将2种异构体面积或峰高值相灿后以总量计算。9精密度
9.1一般规定
本标准的猜密度数据是按照GB/T6379.1和（GB/T637S.2的规定确的，重复性和再现性的值以95%的可信度案计算。
9. 2重复性
在重复性条件下，嵌得的两次独立测试结果的绝对差值不扭过重复性限，米赤避厚、玉米亦案翻、己耀雌酚，己烷雌，双烯雄酸在牛奶中的添加浓度范固及复性方程见表3，在奶粉的添加浓度范国及重复性方程见表 4,
化合物名称
玉米舜醇
己烯燥酸
双烯酸
已烷雌溉
牛奶中的添加浓度范围及量复性和再现性方程添剂浓度范国
1. 0 --1C
注：m为两次测定结果的第术单值复性限
单位为微克升
现性限R
lg r=0. 965 6 lg m ~ 1. 089 7g R=-c. 952 5 lg m0. 712 8
g r=0. 966 0 1g m-1. 144 5
1g r0. 984 4 lg m-1. 093 5
Ig r=0. 073 5 1g m+0. 001 6
r0.97601gm-1.0445
Ig R-C. 915 2 ig w—0. 651 3Ig R=0. 205 & ig m-l- 0. cll 9g R-1. 081 3 ly m:-0. 7$8 2
1g R0. 925 2 Ig m-0. 661 3
表4奶粉中的添加浓度范围及重复性和币现性方程化合物名称
玉来赤翼醇
天米赤响
己烯雌
双烯雌酚
已炕蹄酚
添加波范围
10~100
10~-10
10~:100
70---160
10-·700
注：m为为次测定结果的算本平均值：氯复性限：
Iy r--0.965 8 lg m-1. 08s 7
单位为微克于克
现丝限R
Ig R=0. 962 5 Ig m- 0. 712 81. 144 5Ig R-0. 915 2 1g m—0. 651 3Ig r-0. 066 0 Ig rm
lgr=0.0844lgm
Ig R-.0. 205 8 Ig m I 0. 011 91. 093 5
lgr0.0735lgm-f0.0016：gR1.081.3igzm\c.7982lg r0. 976 0 lg m1. 044 5
1g R= 0. 925 2 lg m 0. 651 3如果差值超过重复性限一，应舍充试验结果并重新完成两次单个试验的测定。9.3再现性
在再现性条件下，获得的两次独立测试结果的绝对差值不超过再现性限，飞米赤每爵、玉米赤需酮、巴烯雌纷、己烷雌酸、双稀雌酚在牛妙中的添加浓度范国及再现性方程见表3，在奶粉中的添加浓度范围及再现性方程见表4。
全品伙伴网htt
GB/1229922008
【资料性附录）
标准物质液相色谱-串联质谱图
下米冰等尊、玉米赤霉酮、己烯雕、巴烷粉、双烯雌酚标推物质液相色谱·州联质谱图，见图A.1.
Mux. 1. 2e4 cps.
s/aiau
181.411.74
3元-40--45
4.31 1.55
253055
6. 0 6.3
M1.1e4cps.
Max. 2. Hel ces..
t/rain
Max.2 33. 6 crs.
Mex. 4 5Re. 5 gs.
7.88_8.208.82
Max. 0 50R.b cps.
7.07.6x08'5.
玉米赤需醇、玉米赤翻、己烯雄酚、已烷雌瀚、双烯雌酚标准物质没相色谱-串联质谱图品伙伴网httn
附录B
(资料性附录）
回收率
GB/T 22992—2008
本方法检测牛奶中的激衰及代谢物恭加浓度及其平均国收率的试验数罐，见表B.1。表B.添加浓度及其平均回收率的试验数据化合物名称
玉来苏荷蔡
已烯旋酚
双烯雌份
卫烷峨酚
添泌度g/)
平考同妆率/%
GB/T 22992-2008
中华人民共和国
国家标雅
牛奶和奶粉中玉米亦雲醇,玉米赤霉、已烯酚、已烷鳍酚、双烯雌酚
残留量的测定
液相色谱-帛联质谱法
G13/T 225922608
中国标准出版社出版发行
北京复兴门外兰里河北街16号
邮政编码；1CC45
刚址 spc. net, cn
电话：6852394688517548
中闲标程出版社奈皇舟印刷印刷各地新华市店经销
开本880×12301/16印张6.75学数 15千字2009任1月第一次印刷
200年4月第一版
书号：155066·1-35838
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