【农业行业标准(NY)】 马铃薯脱毒种薯繁育技术规程

ISC65.020.01
中华人民共和国农业行业标准
NY/T1212—2006
马铃薯脱毒种薯繁育技术规程
（马铃薯脱毒技术规程、脱毒马铃薯基础种薯生产技术规程）Rules for multiplication of certified seed potatoes(Rules for virus eradication of potatoes. Rules for production ofvirus-free foundation seed potatoes)2006-12-06发布
2007-02-01实施
中华人民共和国农业部
且伙伴区
NY/T1212—2006
本标准附录A、附录B、附录C、附录D、附录E、附录F、附录G附录H、附录I、附录J、附录K、附录L是标准的规范性附件。本标准由中华人民共和国农业部提出并归口。本标准的起草单位：农业部薯类产品质量监督检验测试中心（张家口）、河北省高寒作物研究所。本标准主要起草人：尹江、张希近、姚瑞、马恢、高永龙。I
http：//foodmate.net1范围
马铃薯脱毒种薯繁育技术规程
本标准规定了马铃薯脱毒技术、脱毒马铃薯基础种薯生产技术。本标准适用于马铃薯脱毒技术和基础种薯生产。引用标准
NY/T12122006
下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款，凡注明日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误内容）或修订版均不适用本标准，凡不注明日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。
马铃薯种薯产地检疫规程
GB733187
马铃薯种薯生产技术操作规程
GB324382
GB440684
GB18133—2000马铃薯脱毒种薯
NY/T401—2000
3术语和定义
脱毒马铃薯种薯苗）病毒检测技术规程应用茎尖分生组织培养技术，脱去主要危害马铃薯的病毒病及类病毒病。3.2
脱毒试管苗
经检测确认不带马铃薯X病毒（PVX）、马铃薯Y病毒（PVY）、马铃薯S病毒（PVS）马铃薯卷叶病毒（PLRV）的试管苗。
脱毒种薯
脱毒试管苗生产的试管薯、微型薯、网室生产的原原种和继代生产供于大田用的种薯。3.3.1
原原种
Pre-Elite
用试管苗在容器内生产的微型薯（Microtuber）和在防虫网室生产出符合质量标准的种薯。3.3.2
原种Elite
-级原种、二级原种。
一级原种EliteI
用原原种生产出符合一级原种质量标准的种薯。3.3.2.2
二级原种Elite
用一级原种生产出符合二级原种质量标准的种薯。http:/
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病毒株允许率
指马铃薯脱毒种薯田内病毒病株的允许比率。3.5
细菌性病害病株允许率
指马铃薯脱毒种薯的繁殖田内细菌性病害病株的允许比率。3.6
混杂植株允许率
指马铃薯脱毒种薯的繁殖田内混人不同品种植株比率。3.7
有缺陷薯
指畸形、次生、串薯、龟裂、虫口、冻伤、草穿、黑心、空心和机械损伤的块茎。4病害
4.1控制病害
4.1.1病毒病
指马铃薯脱毒种薯紧殖田内具有花叶、卷叶、条斑坏死病毒病的植株。4.1.2马铃薯黑胫病【Eruinia var.atroseptica（VanHall）Dye]或【Erurinia var.carotocora(Jones)Dye).
4.1.3马铃薯青桔病（PseudomonussolanacearumE.F.Smith）。4.2汰除病害
4.2.1马铃薯纺锤块茎类病毒（PotatoSpindleTuberViroid.PSTVd)。4.2.2马铃薯环腐病（Corynebacteriumsepedonicum）（Sieck&Kott）（Skapt&Burkh)。4.2.3马铃薯癌肿病【Symchytriumendobaiticum（Schilb）Pere]。5脱毒技术
所用茎尖组织分生培养茎
5.1培养基制备
5.1.1培养基分装：培养基分装于试管中，加盖管塞。5.1.2消毒：试管置于0.8kg/cm2~1.1kg/cm2消毒锅120C高压灭菌20min。5.2取材
5.2.1取材于经审（认）定品种的腋芽或休眠芽。5.2.2芽段用无菌水冲洗20min~30min后，再用75%酒精浸蘸一下，放入无菌杯内用0.1%升汞水浸泡5min，用无菌水冲洗2次-3次。5.3组培室甲醛溶液熏蒸后，用紫外线灯照射40min。工作人员用肥皂水洗手，75%酒精擦拭消毒，操作用具置烘箱180℃消毒。
5.430倍~40倍双筒简解剖镜下，解针剥离生长点，用解剖针切下0.1mm~0.3mm的生长点，接菌针将生长点移至试管。
6试管苗培养
温度22C~25C，光照时间16h/d，强度2000Lx~3000Lx，培养120d~140d转接到MS培养2

基的试管。
7脱毒苗的病毒鉴定
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试管苗按品种随机编号取样3管，采用酶联免疫吸附（ELISA）检验，无阳性反应再用指示植物鉴定：采用往复双向聚丙烯酰胺凝胶电泳法（R-PRAGE）进行纺锤块茎类病毒复检，检出不带PVX、PVY、PVS、PLRV和PSTVd的脱毒苗。8脱毒试管苗的繁殖
8.1将MS培养基配制成液，装入试管。8.2置于0.8kg/cm2~1.1kg/cm消毒锅灭菌20mine8.3将试管苗置于超净工作台上，试管表面和管塞用75%酒精擦拭消毒，取出脱毒苗，按单茎切段，每个切段带1片小叶摆放在培养基面上。8.4培养温度22℃~25℃，光照18h/d，强度2000Lx~3000Lx。9脱毒种薯生产
9.1试管薯生产
设备、药品、试剂按附录L备制。9.1.1操作程序
9.1.2在超净工作台上将试管苗切段置于MS液体培养基的容器中，每管8个茎段，温度22℃~25C，光强度2000Lx~3000Lx培养25d~30d9.1.3茎段腋芽处长成4片6片叶的小苗在无菌操作的条件下转接到结薯诱导培养基上，MS+BA5mg/L+CCC50mg/L+0.5%活性炭+8%蔗糖配制成液体，置于18C-20℃，16h/d黑暗条件诱导结薯。
9.2微型薯生产
基质是蛭石、珍珠岩、草碳土。9.2.1建造温室，温室下覆0.08mm聚乙烯薄膜，上覆40目~45目尼龙网纱。9.2.2与土壤隔离，均勾铺设5cm。9.2.3浇足水达饱和状态
9.2.4试管苗在温室内炼苗7d，清洁水洗净培养基，按株行距6cm×7cm栽人基质2cm~2.5cm深，裁后小水细喷。
9.2.5裁植后遮阴网遮阴5d~7d，温度保持22℃~25℃，相对湿度85%，缓苗后每7d浇灌营养液一次，自裁植后15d起，每隔7d喷施杀虫剂和杀菌剂一次。9.2.6收获
60d~80d收获，按1g以下，2g~4g、5g~9g、10g以上四个规格分级包装，挂标签，注名品种名称，薯粒规格，数量。
9.2.7收获后在通风干燥的种子库预贮15d～20d后入窖。9.2.8人害后按品种、规格摆放，温度2℃~3℃，湿度75%。9.3原原种生产
9.3.1炼苗
温室地表酒水湿润，管与管之间相隔5m，温度18C20C炼苗7d9.3.2假植
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腐熟沃土装营养钵，钵高10cm、直径5cm，每m300个，钵内浇足水，裁苗后小水细喷，遮阴5d~7da
9.3.3管理
温度25℃~30℃，相对湿度70%，苗高3cm～4cm除尽杂草，松土，苗高5cm根部培沃土一次，10cm出圃。
9.3.4定植
苗龄32d~35d，定植。
9.3.5选地
1500m之内无高代马铃薯和十字”花科作物。9.3.6建立网室，以钢管为材，跨度9.5m，高度2m，40目~45目尼龙网纱覆盖。9.3.7施肥
按马铃薯需N、P、K配方施肥，并防地下害虫。9.3.8定植
早熟品种667m25000株~5500株，中，晚熟品种4000株~4500株，随定植浇透水一次9.3.9喷药
定植30d后防治晚疫病，每隔7d喷施杀虫剂和杀菌剂。9.3.10收获
成熟后立即收获，用通气良好清洁卫生韧性较好的材料包装，加标签、标明品种名称、生产单位、检验人。
9.3.11预购
收获后先在风于种子库预贮7d一10d9.3.12贮窖要甲醛熏蒸，撒生石灰，喷杀菌剂，防鼠害，不同品种单，贮量为窖容量的2/3。9.3.13保管
贮藏温度3℃，湿度70%，通风、窖内清洁卫生、防冻害。10一级原种和二级原种生产
10.1种薯生产
10.1.1500m之内不种高代马铃薯和“十字”花科作物。10.1.2播前种薯催芽。
10.1.330g~50g小薯整薯直播，50以上块茎切种，单块重25g~30g，每块带1~2个芽眼，刀具用高锰酸钾溶液消毒。
10.1.4播种，10cm地温稳定在5℃为适宜播期，深度为9cm~10cmg10.1.5播种密度，早熟品种，667m25000株~5500株，中、晚熟品种4000株~4500株。10.1.6施肥，按设计产量N、P、K配方施肥。10.2田间管理
10.2.1全生育期中耕一次，培土两次。10.2.2浇水和追肥，田间土填持水量60%~70%，现蕾期667m追尿素10kg~15kg。10.2.3去杂去劣
现蕾至盛花期，两次拔除混杂植株与块茎。10.3病虫害防治
10.3.1晚疫病、蚜虫的综合防治4
出苗后40d每隔7d喷杀虫剂和杀菌剂。NY/T12122006
10.4种薯田品种特征特性调查物候、植物、生物学特性及病虫害识别，目测按标准附录H、标准附录I、标准附录K执行。
10.5种薯贮藏期间管理
收获按9.3.11、9.3.12、9.3.13执行。11种薯检验
11.1检验方法
11.1.1类病毒用往复双向聚丙烯酰胺凝胶电泳法（R-PAGE）检验（PSTVd）类病毒11.1.2
病毒病用酶联免疫吸附（ELISA）方法进行（PVX、PVY、PVS、PLRV）检验。11.1.3田间检验。
11.1.3.1原原种的检验，10000株以下随机取样2%，10000株100000株1%，100000株以上0.5%按表1取样方法设点，将检验结果记录于表2中。表1不同繁种田面积的检验点数和检验植株数面积（hm）
0.11~1hm2
率见表3。
原原种
一级原种
二级原种
检验点数和每点抽取植株数
随机抽样检验2个点，每点100株随机抽样检验5个点，每点100株随机抽样检验10个点，每点100株随机抽样检验10个点，每点100株，超出5hm2的面积，划出另一个检验区，按本标准规定的不同面积的检验点，抽取株数进行检验。一级原种和二级原种的检验，全生育期三次检验，现蕾期、盛花期，枯黄期前两周，允许，表2脱毒种薯田间检验带病植株及混杂植株充许率第一次检验（现蕾期）
病害及混杂株（%）
检验标准
11.2.1执行GB18133
11.3检验程序
第二次检验（盛花期）
病害及混杂株（%）
http：/
grwwfoodmate.ne
第三次检验（精黄期前两周）
病害及混杂株（%）bzxz.net
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晶种名称
受检单位
检验地点
检验类别
样品数量
种薯来源
田间裁培管理经过：
混杂及
病株百
（%）
检验人：
合计或
表3马铃薯脱毒种薯田间检验原始数据记录表品种编号
联系电话
病毒病株数
校核人：
检验时间
检验依据
代表面积A/hm2
有无摄像照片
真、细蘑病害病株数
审核人！
11.3.1自繁自用种薯，由繁种单位自检，将检验记录报检验部门备案，需要复检时，由检验部门派人复核检验。出售种苗、种薯由专职机构和种子部门进行检验，签发检验报告。11.4判定规则
11.4.1脱毒种薯分级以脱毒种薯繁殖田所播种的级别，带病植株比率和混杂植株比率为定级标准。11.4.2各级别脱毒种薯的带病毒病株率，黑腔病和青枯病株率以及混杂植株比率三项指标，任何一项不符合原来级别所定质量标准，但又高于下一级别质量标准者，判定结果按降低一个级别定级。http:
uFnodmatono
11.4.3种薯检验合格证
马铃薯脱毒种薯检验合格证
马龄薯脱毒种薯质量检验合格证书年月
种薯生产单位全称：
种薯级别：
品种名称：
编号：
村（单位）
联系方式：
经按中华人民共和国马铃薯脱毒种薯GB/T×XXX×质量标准检验合格。检验人：
检验单位：
联系方式：
12包装、标签
12.1包装
12.1.1用通气良好清洁卫生的材料。12.1.2标准袋净重35kg，内装标签。13标签
（签字）
（印章）
13.1标签选择韧性大，防雨防潮，不易涂改的材料制作。13.2颜色
原原种为白色、一级原种为绿色、二级原种为黄色。13.3标签用蓝色圆珠笔填写，不得空项。13.4标签平展正面置于扎口处。13.5标签设计
马铃薯脱毒种薯
种薯级别
品种名称
合格证书
生产单位
联系方式
验收人
然伴网httn
atninot
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附录A
【规范性附录】
酶联免疫吸附试验法
[Enzyme-Linked Immunosorbent Assay)应用双抗体夹心法（DoubleAntibodySandwichMethod）检测马铃薯脱毒苗是否带有PVX、PVY、PVS、PLRV等主要马铃薯病毒。
A1仪器和设备
A1.1聚乙烯微量滴定板：40孔和96孔，均可使用。A1.2微量可调进样器：需2μL~10μL、10μL~50μL和10μL~200μL三种规格，并附相应规格的塑料头。
A1.3冰箱。
A1.4保温箱：温度设置为37℃。A1.5直径8cm的瓷研及钵锤。
A1.6酶联免疫检测仪：检测辣根过氧化物酶（HorseradishPeroxidase：HRP）标记的酶标记抗体用490nm：波长检测，碱性磷酸（AlkalinePhosphataseAKP）标记的酶标抗体用405nm波长检测。A2应用的化学试剂
所用为分析纯级规格、用水为蒸馏水。A2.1抗体免疫球蛋白（rglobulin）和酶标记抗体（Coniugate）：从某一马铃薯病毒抗血清提取的免疫球蛋白，将其浓度调为1mg/mL，做为包被微量滴定板的抗体。用辣根过氧化物酶标记的某一病毒的免疫球蛋白的酶标记抗体、浓度为1:1000以上，贮藏条件为4℃。A2.2碳酸盐包被缓冲液：pH9.6，1.59gNaCO（碳酸钠），2.93gNaHCOs（碳酸氢钠）加水至1L
A2.3PBSTWeen20缓冲液，pH7.4，8gNaCI（氯化钠）0.2gKHPO（磷酸二氢钾）、2.2gNazHPO-7HO（磷酸氢二钠）或2.9gNazHPO,·12HO，0.2gKCI（氯化钾）加水至1L然后加0.5mLTween20，洗涤微量滴定板用。A2.4样品缓冲液：取PBSTween-20缓冲液100mL，加聚乙烯吡略烧酮（PVP）2g。A2.5底物缓冲液：取0.2mol/LNaHPO4-12HO溶液25.7mL加0.1mol/L柠檬酸溶液24.3mL加水50mL，pH调至5.0（现用现配）临用前加磷苯二胺40mg，30%HO，（过氟化氢）0.15mL混匀，避光放置。应为白色或微黄色溶液。A2.6终止液：为0.2mol/L硫酸溶液，用1体积浓硫酸加9份水。A3操作步骤
A3.1包被微量滴定板：把免疫球蛋白用包被缓冲液按1:1000稀释，用微量进样器向微量滴定板的每一样品孔内加人稀释的免疫球蛋白200L。在37C条件孵育1h（或在4℃条件下过夜）。A3.2洗涤包被的微量滴定板：甩掉微量滴定板中的免疫球蛋白稀释液，再在吸水纸上敲打微量滴定板，除尽残留溶液。向微量滴定板的样品孔中加满洗涤缓冲液，停留30min，甩掉洗涤缓冲液，共洗涤3次，以除尽未吸附的免疫球蛋白。8
A3.3加被检测的样品
NY/T1212—2006
A3.3.1取样：在无菌条件下，从瓶苗上剪下长2cm茎段，散在小研钵内，把取样的试管苗放回原瓶内，封好瓶口，把样品编好号，以便检测结果决定取舍。A3.3.2向小研钵内加样品缓冲液，加入液量依每个样品上样的孔数而定，例如每个样品准备上样个样品孔时，可加人0.4m样品缓冲液，研磨后可得200清液，够上一个样品孔用。A3.3.3加人检测样品：向编好号、洗涤完的微量满滴定板的样品孔内，按样品编号、逐个加人提取的样品液200，每一块微量滴定板上，可设两个阳性对照孔。两个阴性对照孔和两个空白对照孔。A3.3.4把加完样品的微量滴定板，在37℃条件下孵育4h～6h（或在40℃条件下过夜），然后按A3.2洗涤微量滴定板。
A3.3.5加酶标记抗体：把酶标记抗体用样品缓冲液按1:1000稀释。向每个样品孔中加人200L稀释的酶标记抗体。
A3.3.6洗涤微量滴定板：按3:2方法洗涤微量滴定板，以除掉未结合的酶标记抗体。A3.3.7加底物：使用国产酶标检测仪器测定光密度时，向每一样品孔内加底物缓冲液100L。如果用进口Bio-Rad550型等进口酶标检测仪时则可加人200μL底物，当观察到阴性对照孔与阳性对照孔显现的颜色可以明确区分时（辣根过氧化物酶标记的酶标记抗体显现橘红色，碱性磷酸酶标记的抗体显现鲜黄色）；或未设对照样品孔的微量滴定板的一些样品孔之间显现的颜色可以明确区分时，每孔加人30μL终止液，如加人200μL底物缓冲液时则加人50终止液（碱性磷酸酶标记的抗体一般可不加终止液）。
A4结果判定
A4.1目测观察：显现颜色的深浅与病毒相对浓度呈正比。显现白色为阴性反应，记录为“-”，显现淡红色即为阳性反应，记录为“+”，依颜色的逐渐加深记录为“++”和“++”。A4.2用酶联检测仪测定光密度值：样品孔的光密度值大于阴性对照孔光密度值的2倍、即判定为阳性反应（阴性对照孔的光密度值应≤0.1）。5计算结果：
I=m×100%
式中：
I—马铃薯病毒检出率，%；
m—呈阳性反应样品数量：
n—实验室样品数量。
结果用两次重复的算术平均值表示，脱毒苗病毒检出率修约间隔为1，并标明经舍进或未舍未进。
htt
NY/T1212—2006
附录B
（规范性附录）
往复双向聚丙烯酰胺凝胶电泳法(Two-dimensional Polyacrylamide Gel Electrophoresis]应用本法检测脱毒苗是否感染有马铃薯纺锤块茎类病毒。B1范围
规定了马铃薯纺锤块茎类病毒（PSTVd）的检测方法。适于检测马铃薯纺锤块茎类病毒。B2引用标准
GB18133-—2000马铃薯脱毒种薯NY/T401-2000脱毒马铃薯种薯（苗）病毒检测技术规程（检测方法引用NY/T401-2000）B3原理
类病毒分子在自然和变性条件下电泳迁移率不同，变性所引起类病毒核酸的环状结构使其电泳迁移率明显慢于桢分子量的其他线性RNA分子，因而第二向电泳中类病毒核酸的环状结构明显滞后，据此，结合可靠灵敏的银染色技术测定类病毒。B4试剂
本方法所用化学试剂为分析纯极规格，用水为蒸馏水，个别要求无菌水。B4.1盐酸溶液【平（HCI）=1+4】量取盐酸10mL，加人40mL水，混勾。B4.2核酸提取缓冲液[o(CHOH),CNH=12.11g·L-1，P(CioH4N2ONaz.2HO）=3.72gL-1，o（NaCI）=5.88g-L-1）称取三羟甲基氨基甲烷［（CH,OH)CNHs］12.11g，乙二胺四乙酸二钠（CloH4NOgNaz-2HO）3.72g，氯化钠（NaCI）5.88g溶于900mL水中，用盐酸溶液（4.1）通过酸度计（5.1）调pH为9.0~9.5，定容至1000mLB4.3TAE缓冲液忙液【o(CHOH),CNH=48.46gL-1，P（CHCOONa）=16.40gL-1，p（CloH4N2OgNa2-2HO）=7.44g-L-]称取三羟甲基氨基甲烷［（CHOH)gCNH］48.46g，无水乙酸钠（CHCOONa）16.40g：乙二胺四乙酸二销（CHN,ONa2H,O）7.44g，溶于900mL水中，用冰乙酸通过酸度计（5.4）调pH为8.1，定容至1000mL。B4.4TAE缓冲液工作液［pl(CHOH)CNHa=4.85g-L-，e（CHCOONa）=1.64gL-P（CoHlNzOgNa22HO）=0.74gL量取TAE缓冲液贴液（4.3）200mL，加水1800mLB4.5TBE电泳缓冲液贮液［pl(CHOH),CNH）=107.8gL-1，p（HgBO）=55.0gL-1，P（C1oHi4N2ONa2·2H2O）=9.3g·L-1】称取三羟甲基氨基甲烷[（CH2OH)3CNH]107.8g，翻酸（HBO）55.0g，乙二胺四乙酸二钠（CnH14N2OgNaz2HO）9.3g溶于少量水中，定容至1000mLo
B4.6TBE电泳缓冲液工作液［pl（CH,OH)CNH=10.78g-L-1，p（H,BO）=5.50gL-，P（CoH4NzOgNaz-2HO）=0.93g-L-1）量取变性电冰缓冲液忙液（4.5）200mL，加水1800mLB4.7低盐溶液［p（NaCI）=11.7g-L-1]称取9.35g氧化钠（NaCI）溶于800mLTAE缓冲液工作液（4.4）中，0.1MPa灭菌30min。10
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