【国家标准(GB)】 嗜酸氧化亚铁硫杆菌及其活性的基因芯片检测方法

1CS 07.100. 01
中华人民共和国国家标准
GB/T20929—2007
嗜酸氧化亚铁硫杆菌及其活性的基因芯片检测方法
The methods of testing acidithiobacillus ferrooxidans andits activity by microarray technology2007-04-30发布
中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中国国家标准化管理委员会
2007-11-01实施
本标准由中国有色金属工业协会提出。言
本标准由全国有色金属标准化技术委员会归口。本标准由中南大学资源加工与生物工程学院负责起草本标准主要起草人：邱冠周、刘学端、柳建设、刘新星、申丽、王军。本标准由全国有色金属标准化技术委员会负责解释。GB/T20929—2007
GB/T20929—2007
生物冶金是利用以矿物为营养基质的微生物将矿物氧化分解，从而使金属进人溶液，通过进一步分离、富集、纯化而提取金属的高新技术，它具有流程短、成本低、环境友好和低污染等优点，尤其在低品位、复杂难处理矿产资源的开发利用中，显示出强大的优势，可以大幅度提高矿产资源的开发利用率和资源的保障程度。
生物冶金速度慢、漫出率低是国际上未能解决的难题。特别是原生矿（如黄铜矿CuFeS.）生物冶金速度慢的问题最为突出，主要原因是缺乏高效的浸矿微生物菌种，其关键是没有一个统一的来自微生物本身的标准来评判微生物浸矿性能。2000年以来，中南大学开展了模式嗜酸氧化亚铁硫杆菌ATCC23270的研究，获得了该菌3217个基因序列信息。本标准是以该菌作为模式菌，利用基因芯片技术，建立嗜酸氧化亚铁硫杆菌及其活性的基因芯片检测方法。
1范围
嗜酸氧化亚铁硫杆菌及其活性的基因芯片检测方法
GB/T20929--2007
本标准规定了利用基因芯片技术检测嗜酸氧化亚铁硫杆菌（以下简称A，f菌）及其活性的术语、定义、符号、省略语、主要技术指标和待测样品的要求、样品图谱的制作及分析方法。本标准适用于利用基因芯片技术来高效快速的鉴别A.f菌.并确定待测样品中A.f菌株的氧化活性。
2方法原理
A.f菌的浸矿性能与其对亚铁和流的氧化能力及其环境适应性相关，而这些特征主要受基因控制。利用获得的纯A.f标准菌ATC°23270及其全部3217个基因1序列信息构建高通量的基因芯片技术，通过不同活性类型（高氧化活性菌和低鼠化活性菌）A，南与站因芯片杂交，找到高氧化活性菌的特征基因及其与浸矿作用密切相关的功能基持的表达情况.根待测样品特征基因的有无和比例以及功能基因的表达水平评定A.f菌的浸矿性能。3术语和定义
下列术语、定义、符号和缩略语适用于本标准。3.1
A.f菌acidithiobacillus ferroxidans属于原核生物门、细菌纲、硫化细菌科、硫杆菌属，革长朗性，有鞭毛。该菌好氧嗜酸、化能自养，能氧化金属硫化物，将Fe+氧化成F。将还原态的研氧化成S),2-，是生物冶金中最常用的菌种。3.2
基因芯片microarraytechnology将大量基因片段以预先设计的方式固定在片基上组成的密集分子排列。3.3
microarraygeneexpressionprofiles基因芯片图谱
将荧光标记的靶分子与芯片上的探针分子杂交后，通过激光共聚焦扫描所获得的图像和数据。3.4
生物冶金biohydro-metallurgy
一种利用以矿物为营养基质的微生物.将矿物氧化分解后，再进一步分离提取金属的工艺。3.5
探针probe
DNA探针是指能识别特定碱基序列的经过人工标记的一小段单链DNA分子，即一段与被测定的核苷酸序列(靶序列)互补的带标记的单链脱氧核糖核苷酸。3.6
荧光标记labellingusingfluorescentdyes在基因组DNA扩增过程中，将带有Cy3(4.1.14)或Cy5(4.1.13)荧光素的dUTP或dCTP加人到新合成的DNA链，使新合成的DNA链带有荧光标识。177
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基因芯片杂交microarrayhybridization使带有荧光标记的gDNA/cDNA与基因芯片上的探针进行特异性互补结合的过程。3.8
基因芯片扫描microarray scanning将杂交后的基因芯片置于芯片扫描仪内获得不同探针杂交信号强度的全貌图。3.9
富集培养enrichmentculture
利用不同微生物间生命活动特点的差异，制定特定的培养条件，使仅适应于该条件的微生物旺盛生长，从而使其在群落中的数量大大增加，并能更容易分离到所需的特定微生物。3.10
纯培养pureculture
在人为规定的条件下培养，由单一细胞繁殖所获得自的细菌的技术。3.11
扩大培养propagateculture
将纯培养的细菌置于培养基以增加纯培养中菌株数量的技术。3.12
A.模式菌（ATCC23270）
确定A.f种的特性所选用的代表性菌株。3.13
PCR(Polymerase chain reaction)即DNA聚合酶链反应，是一种特异性DNA序列的体外酶促合成与扩增技术。3.14
rep-PCR(RepetitiveElementSeguence-BasedPCR)利用REP序列引物扩增细菌基因组DNA的重复性元件，经琼脂糖凝胶电泳检测其多态性的一种鉴定微生物的方法。
box-PCR
利用BOX序列引物扩增细菌基因组DNA的重复性元件，经琼脂糖凝胶电泳检测其多态性的一种鉴定微生物的方法。
A250/A280
样品在260nm处的光吸收值与280nm处的光吸收值的比值。3.17
A260/A230
样品在260nm处的光吸收值与230nm处的光吸收值的比值。4试剂和材料
本试验所用水为高纯水（电阻率大于18Ma)。4.1试剂
4.1.1十二烷基磺酸钠SDS，分子式：CH（CH，）oCH,SONa浓度（质量分数）：0.2%4.1.2硫酸亚铁FeSO.
4.1.3苯酚C.H.OH
4.1.4氯仿CHCls
异丙醇（CH，）CHOH
乙醇CH.OH
乙酸钠CH，COONa，3mol/L
甲酰胺C.H,NO
二甲基亚砜（CH）SO
氢氧化钠NaOH，1mol/L
盐酸HCI,1mol/L
蓝色荧光标记cy5（CaH3?NzO.SzK）红色荧光标记cy3(CHa2NzO.SzK）新鲜蛋白酶K溶液
4.2溶液
4.2.19K培养基（pH2.0~pH2.5)
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准确秤取(NH),SO.3 g,KCI 0. 1 g,K,HPO.0. 5 g, MgSO,· H,O 0. 5 g,Ca(NO,)z 0. 01 g,FeSO.·7H2044.3g，吸取浓度为5mol/L的H,SO.1.0mL，蒸馏水1000mL混合均勾得到9K培养基。4.2.2RnaseMini Kit试剂盒
成份：无Rnase水，缓冲液RLT、RDD、RPE，漂洗液RW1，存液DnaseI。4.2.3DNA荧光标记试剂盒
4.2.3.1DNA荧光标记混合液1(每管35μL)的配置随机引物缓冲液20μL，DNAuL（总量500ng），dHzO(15-z）μL。4.2.3.2DNA荧光标记混合液2（每管15μL)的配置dNTP(5mmol/LdA/G/CTP.2.5mmol/LdTTP)1μL,klenow2μL,Cy3/Cy5dUTP0.5μL,dH,011.5μL。
4.2.3.3Tris-HCI的配置
浓度0.1mol/L+pH为7或7.5。
4.2.4RNA荧光标记试剂盒
4.2.4.1RNA荧光标记混合液1的配置加入RNA10μg，随机引物缓冲液10μg。4.2.4.2RNA荧光标记混合液2的配置加人5倍缓冲液6μL,0.1mol/LDTT3μL，dNTP(10mmol/LdA/G/CTP、0.5mmol/LdTTP）0.5μL,RNA酶抑制剂1μL,1mmol/Lcy3(4.1.14)/cy5(4.1.13)dUTP1μL。4.2.5杂交溶液
4.2.5.1杂交混合液1的配置
甲酰胺15μL，纯水5.6μL。
4.2.5.2杂交混合液2的配置
鱼精DNA2.4μL，5%SDS2μL，20倍SSC5.4μL（每管溶液总体积为30μL）。4.3材料
用作对照的菌株为模式A.f菌ATCC23270，由美国模式菌种收集中心（AmericanTypeCultureCollection，简称ATCC)保存并提供。5仪器、设备
5.1DNA扩增仪（PCR仪）
5.2分光光度计
能测量DNA和RNA浓度和纯度。
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5.3基因芯片点样仪
通量50张玻片以上，步进精度1uμm~2.5μm（X、Y轴和Z轴），点的平均大小为75μm～300μm，点样密度：>10000点/标准玻片。5.4基因芯片扫描仪
最大扫描区域22mm×71.5mm，两组激光器（绿色和红色荧光，适用Cy3（4.1.14）/Cy5（4.1.13）标记），最大分辨率为5μm，在分辨率范围内5μm～100μm可自由选择，检测灵敏度0.05分子/μm以下，变异系数均小于5%。此内容来自标准下载网
6样品制作
6.1取样要求
6.1.1采样地点
从典型的酸性矿坑水、积液池或浸矿堆采样，确保样品具有代表性。6.1.2采样温度
要求气温在15℃以上。
6.1.3采样方法
在每一样地采用5点取样法采样，并将所采样品混合后用于富集培养。6.2样品的富集培养及其要求
采用9K培养基（4.2.1)(pH2.0~pH2.5)以FeSO,（4.1.2)作为能源对样品进行3次以上的富集培养，在显微镜下直接观察80%以上菌体为杆状。于指数生长期收集菌液进行纯化培养。6.3纯培养及其要求
样品需要经过3次以上单菌落分离。使其细菌个体、菌落在形态上基本保持一致。6.4纯培养物的检验
对纯培养后的样品进行单菌落分离，并随机挑取其中10个以上的单菌落，利用特定的引物扩增细菌基因组DNA的重复性元件，根据凝胶电泳谱带分析判定样品的一致性。可使用如下方法之：rep-PCR：利用REP序列作为引物进行PCR；box-PCR：利用BOX序列作为引物进行PCR。注：如抽取的所有单菌落基因组DNAPCR产物凝胶电泳谱带均相同，可认定待测样品为纯培养物。否则继续进行单菌落分离，直至达到上述要求。6.5纯培养菌株的贮存与运输
6.5.1贮存
采用9K液体培养基，将纯培养菌株扩大培养至对数生长期（菌浓度达到10°个/mL），过滤去除黄钾铁钒，以5000r/min离心分离20min，浓缩100倍后作为保藏菌液。将浓缩后的细菌液用无菌蒸罐水（pH6.0～pH7.0）悬浮，置于4℃保藏。6.5.2运输
保持在4℃条件下贮运。
6.5.3保存期
样品按上述方法进行贮存和运输，保存时间不得超过40天。7分析步骤
7.1样品扩大培养
使用9K培养基（4.2.1)进行样品的扩大培养，使细菌浓度不低于10°个/mL，总量不得少于2L。7.2测定次数
在重复性试验条件下，每个样品至少测定三次。180
7.3空白试验
用美国模式菌种收集中心保存并提供的模式A.f菌ATCC23270作对照。7.4模式A.f菌基因芯片的制作
7.4.1A,f菌全基因组序列
A.f菌全基因组序列共鉴定出3217个基因。GB/T20929—2007
7.4.2探针的设计与合成
根据A.f菌全部3217个基因序列信息，应用引物设计软件PRIMEGENS的修订版设计，共选得3217个寡聚核苷酸探针。同时，针对性的挑选人类基因和植物基因作为阴性对照或定量对照。此外，还以A.f 菌的基因组DNA作为阳性对照。7.4.3芯片点样
将合成后的探针置于样品盘内，芯片点样前，用二甲基亚砜（4.1.9）将探针稀释至一定浓度，并转到点样样品盘内。在严格的环境条件下（温度：20℃～25℃；相对湿度：50以~60%；洁净度：1000级～10000级），用自动芯片点样仪将探针点在固体片基表面。7.4.4芯片点样后处理
将制作好的芯片用经紫外交联固定.川SIDS(1.1.1)洗涤.再用灭菌水洗涤，风干备用。7.4.5芯片质量的检验
点样后的芯片，直接用CCD打描检餐质量，合格的志料其样点饱满、大小均匀。7.5样品菌株和模式菌株基因组IDNA/RNA的提取与纯化7.5.1基因组DyA的提取与纯化
对样品菌株和模式菌株同时按照以下步进行基内组DNA的提取与纯化：7.5.1.1细胞裂解，培养500nl.1000mL细菌培养物至对数增长期；过滤去除沉淀物，将培养物转至灭菌离心分离管中，以3600mi离心分离10min：例除t清液；向细菌沉淀中加入20mL提取缓冲液，振荡5s-i0s至菌体彻底总浮，迅速问管中加入10gul的100μL新鲜蛋白酶K溶液（4.1.15），用涡流搅拌器搅拌混匀，加人20%SDS（4.1:l)2ml，震荡5s～10s混匀，再在65℃~70℃水浴下反应2h，每隔15min~t)min180°颠倒3次：，7.5.1.2DNA粗提，将样品移出水溶.冷席5min：人10ml.米酚（4.1.3）和10mL氯仿（4.1.4），震荡5min10min.混合均匀，以yrnin离心分离20min.川移液管小心将上清液吸出，转到另外一个50mlL灭菌离心分离管中。加人20ml氯伤（4.1.4），震荡min混匀，以3600r/min离心分离20min，移出上清液转移到50mL新管中；加入所获上清液0.6倍～1倍体积的异丙醇（4.1.5），小心混匀，一般可见絮状沉淀。如无絮状沉淀则表明DNA浓度太低，此时应将样品于一20℃下静置12h再离心分离。
7.5.1.3DNA初步纯化，用钩形玻璃器Ⅲ挑取DNA状沉淀或！000r/min离心分离获得DNA沉淀物，用70%乙醇（4.1.6）清洗；将清洗后的DNA絮状沉淀放入2mL灭菌离心分离管中，加入100μL~500μL无菌水在50℃条件下使之溶解，对通过离心分离获得的DNA沉淀物，用乙醇（4.1.6）清洗后，以12000r/min离心分离20min，除去上清液，DNA沉淀用100μL~500μL无菌水50℃条件下溶解。7.5.1.4DNA进一步纯化，加人20μL5μg/μLRnase（去RNA）在37℃条件下反应30min；加人500μL氯仿（4.1.4），混合均匀，以14000r/min离心分离5min～10min，吸出上清液，转到另一新的2mL灭菌离心分离管中；加入所获上清液1/10体积的乙酸钠（4.1.7)和1mL乙醇（4.1.6）小心混合均勾，此时一般会出现絮状DNA沉淀，否则将样品于一20℃静置12h。用钩形玻璃器Ⅲ挑取DNA沉淀物，移至装有70%乙醇（4.1.6）的离心分离管内；将沉淀放人2mL灭菌离心分离管中，加入100μL~200μL无菌水在50℃条件下溶解DNA，放置12h~16h；7.5.1.5DNA浓度纯度测定，DNA的数量通过分光光度计测定，其浓度应达到100ng/μL以上；181
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DNA的纯度通过A260/A280和A260/A23的比率确定，应大于1.8。7.5.2菌株总RNA的提取与纯化
7.5.2.1RNA的提取
对样品菌株和模式菌株同时按照以下步骤进行细菌总RNA的提取：7.5.2.1.1培养500mL~1000mL细菌培养物至对数增长期；在4℃下过滤去除黄钾铁钒，将培养物转至灭菌离心分离管中，在4℃条件下，3600/min离心分离10min，除去上清液；溶菌，用TRIzol解释试剂反复抽提，每107个细菌细胞加入1mL试剂。7.5.2.1.2分离，对已成微粒状的样品，在15℃～30℃的条件下反应5min，每1mLTRIzol试剂中加人0.2mL氯仿（4.1.4），震荡5s~10s混匀，在15℃~30℃下反应2min~3min，再在4℃的条件下以12000r/min离心分离15min，离心分离后溶液从下至上分为红色液层、苯酚-氯仿层、界面层和无色水相层，RNA就存在于水相层；沉淀，小心吸出水相层转移到新管中，利用异丙醇（4.1.5）沉淀RNA，每1mLTRIzol试剂中加入0.5mL异丙醇（4.1.5）,15℃～30℃下反应10min，在2℃~4℃下，以12000r/min离心分离10min。
7.5.2.1.3洗涤，倒除上清，每1mLTRIzol试剂中加人1mL75%的乙醇（4.1.6)来清洗RNA沉淀，混合均匀，在2℃～8℃下，10000r/min离心分离5min。7.5.2.1.4再溶，利用空气干燥器或者真空干燥机干燥RNA沉淀5min~10min，加人无RNase的无菌水或者0.5%的SDS（4.1.1），用移液枪反复抽提，再在55℃～60℃条件下反应10min，用100%的去离子甲酰胺（4.1.8)溶解RNA，在一70℃下保存。7.5.2.2RNA的纯化
RNA的纯化利用RnaseMiniKit试剂盒（4.2.2）按照以下步骤进行：7.5.2.2.1将样品置于100.μL无Rnase水中，加人350μLRLT缓冲液，彻底混合均匀；加人250μL无水乙醇（4.1.6），用吸液管彻底混合清洗RNA，并迅速进行下一步骤；将70QuL样品置于吸附柱内（吸附柱放在收集管中），以12000r/min离心分离15s后，去除废液。7.5.2.2.2向吸附柱内加人350μL漂洗液RW1，以10000r/min离心分离15s后，去除废液，将吸附柱放人新的收集管中；加入10μLDnaseI贮存液和70μLRDD缓冲液，小心上下倒置混合均匀，在室温放置15min；向吸附柱加入350μL缓冲液RW1，以10000r/min离心分离15s，去除废液，将吸附柱放入新的收集管中；加人500μL缓冲液RPE，以12000r/min离心分离15s后，去除废液。7.5.2.2.3再加人500μL缓冲液RPE，以12000r/min离心分离2min后，去除废液，将吸附柱放人新的1.5mL收集管中；加人30μL～50μL无Rnase水，以12000r/min离心分离1min。7.5.2.2.4RNA的数量通过分光光度计测定，其浓度应达到300ng/μL以上；RNA的纯度通过A260/A280和A260/A230的比率确定，应大于1.8。7.6荧光标记
7.6.1基因组DNA荧光标记
将所获得的样品菌株和模式菌株DNA同时用DNA荧光标记试剂盒进行荧光标记，步骤如下：7.6.1.1每管加人35μLDNA荧光标记混合液1（4.2.3.1），并在98℃条件下加热5min；置于冰土快速冷却5min，离心分离10s；将DNA荧光标记混合液2（4.2.3.2）加入到盛有混合液1的管中，每管15μL（管中总体积为50μL），在37℃条件下反应3h；在98℃条件下反应3min，置于冰上快速冷却5min。
7.6.1.2加人2.5μLNaOH（4.1.10)，在37℃条件下反应10min；再加人2.5μLHCI（4.1.11)以中和管中溶液；加入5μLTris-HCl(4.2.3.3)；利用纯化试剂盒进行纯化。7.6.1.3放人真空干燥机中在45℃条件下浓缩和干燥荧光标记的溶液，大约40min～50min。182
7.6.2RNA荧光标记
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RNA的荧光标记用RNA荧光标记试剂盒进行荧光标记，按照以下步骤进行：7.6.2.1加人RNA荧光标记混合液1（4.2.4.1)用蒸馏水补充至总体积16.5μL；70℃下反应10min；置于冰上快速冷却。
7.6.2.2加入RNA荧光标记混合液2(4.2.4.2）；常温下反应10min；加人1uL逆转录酶，在42℃条件下反应2h；98℃条件下反应2min，置于冰上快速冷却。7.6.2.3加入2.5μLNaOH（4.1.10），在37℃条件下反应10min；再加人2.5μLHC1(4.1.12）以中和管中溶液；加入5μLTris-HCI(4.2.3.3)；利用纯化试剂盒进行纯化。7.6.2.4放入真空干燥机中在45℃条件下浓缩和干燥荧光标记的溶液，大约40min~50min。7.6.3标记效率的测定
将所获得的标记物用分光光度计测定标记效率，合格的标记物每20个～60个核苷酸分子插入有一个荧光标记的寡核苷酸。
7.7芯片杂交
取标记量相等的样品荧光标记产物和模式菌荧光标记产物混合，用杂交溶液，按下列步骤进行杂交：
将标记物用杂交混合液1（4.2.5.1)溶解、悬浮，转移到小管；每管中加人杂交混合液2（4.2.5.2）；芯片上杂交；于50℃水浴中放置12h；洗涤。7.8芯片扫描与数据分析
7.8.1芯片扫描
应用激光共聚焦扫描仪，在分辨辩率10μm下对基因芯片进行扫描。激发光源为绿色HeNe或红色HeNe，分别确定于所使用的荧光素Cy3（4.1.14)或Cy5（4.1.13），荧光素所发射的荧光由光电倍增管(PMT)在532nm-Cy3(4.1.14)或635nm-Cy5(4.1.13）进行探测。7.8.2芯片图像处理
芯片图像处理是将扫描获得的图像以16位TIFF文件保存，然后用芯片分析软件对每一个杂交点的光素密度(或强度)进行定量分析。7.8.3背景信号的矫正
背景信号的矫正是将一个用来定义阵列中每一个DNA杂交点的圆圈叠加在图像上，用以确定每一个被定量分析的荧光点，将每一荧光点所获得的平均荧光强度作为其信号强度值，局部背景信号被自动地从每一单独的荧光点杂交信号中减去；同时，从每一个杂交信号值中减去所有人类基因和植物基因(阴性对照）荧光强度的平均值，作为杂交强度最后的定量值，按公式(1)计算其信噪比(SingnaltoNoiseRatio，SNR），将SNR=3定为信号强度最小阀值，并将小于最小阈值的杂交点从数据集中去掉。SNR
式中：
SNR—信噪比；
1—信号强度值；
y—背景强度值；
2背景标准偏差。
7.8.4芯片数据的标准化和转换
当用2种荧光素Cy3(4.1,14)和Cy5(4.1.13)同时标记并与同一张芯片杂交时，杂交信号强度值以一同加人的人类基因（0.1ng）强度值来校正，具体方法是，先计算所选的3个人类基因Cy5（4.1.13）/Cy3（4.1.14）信号强度的平均比值，再将Cy3（4.1.14）信号强度值乘以这一比值得到Cy3183
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(4.1.14)信号强度的校正值。
7.9数据分析
将所获得的样品菌与标准菌的每一杂交点信号强度比值作进一步分析。7.9.1分析内容
将所获得的杂交点信号强度比值作如下方面的分析：7.9.1.1基因组DNA与基因芯片杂交后，获取样品菌基因的杂交信号，将杂交信号与模式菌ATCC23270的3217个基因杂交信号进行比较，统计比值大于或等于0.5的基因数量，并计算其占模式菌3217个基因的比例。
7.9.1.2基因组DNA与基因芯片杂交后，获取样品菌中直接与矿物氧化密切相关的320个特征基因的杂交信号，将杂交信号与模式菌ATCC23270相应的320个基因杂交信号进行比较，统计比值大于或等于0.5的基因数量，并计算其占模式菌320个基因的比例。7.9.1.3cDNA与芯片杂交后，获取样品菌的135个重要功能基因的杂交信号，将杂交信号与模式菌ATCC23270相应的135个基因杂交信号进行比较，统计比值大于或等于2.0的基因数量，并计算其占模式菌135个基因的比例。
7.9.2填表
将上述三个比例值填入表1。
表1A.f菌基因芯片检测特征值
检测方法
基因组DNA杂交
RNA杂交
注1：a为样品菌基因的杂交信号与模式菌基因杂交信号比值大于或等于0.5的基因数量。检测结果
注2：b为样品菌中320个特征基因的杂交信号与模式菌ATCC23270相应基因杂交信号比值大于或等于0.5的基因数量。
注3：c为样品菌的135个重要功能基因中杂交信号强度与模式菌ATCC23270相应的基因序列信号比值大于或等于2.0的基因数量。
8结果判定
8.1A.f菌判断标准
将样品菌基因的杂交信号与模式菌ATCC23270的3217个基因杂交信号进行比较，统计比值大于或等于0.5的基因数量，并计算其占模式菌3217个基因的比例，其比例应大于或等于70%。8.2高活性A.f菌的判断标准
8.2.1结构基因组水平检测
样品菌中直接与矿物氧化密切相关的320个特征基因的杂交信号与模式菌ATCC23270相应的320个基因杂交信号进行比较，比值均应大于或等于0.5。184
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8.2.2从功能基因组水平检测
样品菌的135个重要功能基因中杂交信号强度与ATCC23270相应的135个基因进行比较，统计比值大于或等于2.0的基因数量，并计算其占135个重要功能基因的比例，其比例应大于或等于60%。8.3出具检测报告
A.f菌及其活性在基因芯片上检测出的特征值用表1来描述。185
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