【国家标准(GB)】 实验动物 狂犬病病毒检测方法

ICS 65.020.30
中华人民共和国国家标准　
GB/T14926.56—2008
代替GB/T14926.56—2001
实验动物
狂犬病病毒检测方法
Laboratory animal-Method for examination of Rabies virus2008-12-10发布
中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局数码防伪
中国国家标准化管理委员会
2009-03-01实施
GB/T14926《实验动物》共54个部分，为不同微生物和病毒检测技术方法。GB/T14926.56-—2008
本部分自实施之日起代替GB/T14926.56一2001《实验动物狂犬病病毒检测方法》。本部分与GB/T14926.56一2001相比主要技术差异如下：删除原标准中“2引用标准”内容；a）
对原标准中“3原理”中所有内容改为“在微孔板上预包被纯化狂犬病毒抗原，使免疫反应在固相载体上进行。当被检血清中有狂犬病病毒抗体存在时，则与孔壁上的抗原形成抗原-抗体复合物，再与抗犬IgG酶标记物反应，最后通过测定酶作用底物催化后的产物，进行定性检测”
删除原标准中所有关于血凝抑制试验的试剂、方法及结果判定；c）
对原标准中所有关于酶联免疫吸附试验的内容进行修改，包括试剂、方法及结果判定等；对原标准中“6结果判定”中增加了“6.3基础级犬群体免疫抗体合格率：免疫抗体合格率e)
（被检动物抗体阳性数/被检动物总数）×100%。基础级犬群体免疫抗体合格率达到70%以上可判为该犬群免疫合格”内容。本部分由全国实验动物标准化技术委员会提出并归口。本部分由全国实验动物标准化技术委员会负责起草。本部分主要起草人：田克恭、陈西钊、曹振、王传彬、何秀敏、汤汉文。本部分所代替标准的历次版本发布情况为：-GB/T14926.56-2001。
1范围
实验动物
狂犬病病毒检测方法
GB/T14926的本部分规定了狂犬病病毒(RV)的检测方法、试剂等。本部分适用于犬RV的检测。
2原理
GB/T14926.56—2008
在微孔板上预包被纯化狂犬病毒抗原，使免疫反应在固相载体上进行。当被检血清中有狂犬病病毒抗体存在时，则与孔壁上的抗原形成抗原-抗体复合物，再与抗犬IgG酶标记物反应，最后通过测定酶作用底物催化后的产物，进行定性检测。3主要试剂和器材
3.1试剂
犬狂犬病毒IgG抗体检测试剂盒（定性），包括：a）预包被狂犬病毒抗原的微孔板；b）
狂犬病毒IgG酶标记物；
狂犬病毒IgG阳性对照；
狂犬病毒IgG临界对照；
狂犬病毒IgG阴性对照；
显色液A：磷酸氢=钠-柠檬酸缓冲液（0.05mol/L，pH5.0）1000mL，30%过氧化氢HzOzf）
(MW34.0)3.5mL;
显色液B：柠檬酸1.052g，乙二胺四乙酸二钠（EDTA-Naz）0.186g，四甲基联苯胺（TMB）g）
0.25g，二甲基亚砜(DMSO)8.0mL，纯化水992mL；终止液：98%硫酸27.8mL，纯化水972.2mL：h）bZxz.net
i）10倍浓缩洗涤液：PBS(0.1mol/LpH7.2~7.4)995mL，吐温-20,5mL；样品稀释液：硼酸盐缓冲液（0.01mol/LpH8.0)956.0mL，甘油（MW92.09)40.0mL，酪蛋白j
（casein)10%硫柳汞钠溶液2.0mL，吐温-20，1.0mL1%酚红溶液，1.0mL。试剂在使用前应恢复至室温（18℃～25℃）。3.2器材
器材包括：
a）精密移液器10μL～100μL；b）一次性移液器吸头；
c）振荡器；
酶标仪（含450nm波长滤光片）；e）
37℃恒温培养箱；
蒸馏水或去离子水；
100mL量筒；
离心机；
吸水纸。
GB/T14926.56—2008
4检测方法
4.1样品的准备
将采集到的待检犬血液样品离心，分离出待检犬血清或血浆。应避免使用染菌、溶血和高血脂的样品；室温保存样品不应超过8h，若试验在8h以后进行，需将样品保存在2℃～10℃，如保存超过1周，则应保存在一20℃并避免反复冻融。4.2试剂配置
将10倍浓缩洗涤液恢复至室温，并振摇，然后用去离子水或蒸馏水作10倍稀释。4.3稀释样品
将已分离好的犬血清或血浆用样品稀释液做1：10稀释，即取50μL血清或血浆加人到500μL样品稀释液中，并充分混匀。
4.4加样
取所需量的预包被微孔板条固定于板架上，依次加入稀释好的样品，100μL/孔，然后将阳性、阴性对照各加1孔，临界对照加3孔，100μL/孔，另留一孔不加样品作为空白对照，在记录纸上记录各样品和对照的次序或位置，剩余的板条放人密封袋中保存。4.5孵育
加样完成后，用封板膜覆盖板条，置37℃恒温培养箱中孵育30min。4.6洗板
甩净孔中液体，拍干，用稀释好的洗涤液加满每孔，停留1min后甩净、拍干，如此重复洗涤3次。4.7加酶
除空白对照外，其余各孔垂直滴加酶标记物1滴（50μL），置37℃恒温培养箱孵育30min。4.8显色
重复步骤4.6洗板3次，拍干后每孔（含空白对照孔）垂直滴加显色液A、B液各1滴，置37℃恒温培养箱避光显色10min。
4.9终止
每孔（含空白对照孔）立即加人终止液1滴，混匀后以空白孔调零，用酶标仪450nm波长测定A值。
5结果判定
5.1试验结果符合下列条件，方为有效：以空白孔调零，阴性对照值小于等于0.10，临界对照A值应在0.15～0.40之间，证明试验成立。5.2结果判定
5.2.1待检样品A值大于等于临界对照A值的平均值，判为阳性；5.2.2待检样品A值小于临界对照A值的平均值，判为阴性。6结巢解释
6.1基础级犬：接种疫苗后，经ELISA检测抗体效价达到阳性值判为合格。6.2SPF级犬，不应进行疫苗接种，对阳性检测结果，选用同一种方法或另一种方法重试。如为阳性则判为阳性。
6.3基础级犬群体免疫抗体合格率：免疫抗体合格率=（被检动物抗体阳性数/被检动物总数)×100%基础级犬群体免疫抗体合格率达到70%以上可判为该犬群免疫合格。2
结果报告
根据判定结果，作出报告。
GB/T14926.56—2008
GB/T14926.56-2008
#和国
中华人民共
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实验动物
狂犬病病毒检测方法
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字数7千字
：2009年2月第一次印刷
2009年2月第一版
书号：155066·1-35768定价10.00元如有印装差错
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