【国家标准(GB)】 化学品 快速生物降解性 呼吸计量法试验

ICS13.300;13.020.40
中华人民共和国国家标准
GB/T21801--2008
化学品
快速生物降解性
呼吸计量法试验
Chemicals-Readybiodegradability-Manometric respirometrytest2008-05-12发布
中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中国国家标准化管理委员会
2008-09-01实施
术语和定义
受试物信息
方法概述
试验准备
试验程序
质量保证与质量控制
数据与报告
.......
附录A（资料性附录）
附录B（资料性附录）
附录C(资料性附录）
附录D（资料性附录）
附录E（资料性附录）
受试物对接种物生长抑制作用的处理难溶性受试物的处理
相应参数的计算和确定
硝化作用氧消耗的校正
呼吸计量法试验数据表
GB/T21801—2008
GB/T21801—2008
本标准等同采用经济合作与发展组织（OECD)化学品测试导则No.301F（1992年）《快速生物降解性：呼吸计量法试验》（英文版）。本标准做了下列编辑性修改：
将计量单位改为我国法定计量单位。本标准的附录A、附录B、附录C、附录D和附录E为资料性附录。本标准由全国危险化学品管理标准化技术委员会（SAC/TC251)提出并归口。本标准负责起草单位：环境保护部化学品登记中心。本标准参加起草单位：上海市检测中心、上海市环境科学研究院、环境保护部南京环境科学研究所。本标准主要起草人：聂晶磊、刘纯新、渠开山、陈晓倩、殷浩文、沈根祥、刘济宁。1范围
化学品快速生物降解性
呼吸计量法试验
GB/T21801—2008
本标准规定了化学品快速生物降解性呼吸计量法试验的方法概述、试验准备、试验程序、质量保证与质量控制、数据与报告。
本标准适用于测试与评价化学有机物的快速生物降解性。2
术语和定义
下列定义和术语适用于本标准
readybiodegradability
快速生物降解性
受试物在限定时间内与接种物接触表现出的生物降解能力。2.2
初级生物降解primarybiodegradation受试物在生物作用下化学结构发生变化致使特性丧失的过程。2.3
dissolvedorganiccarbon,DOC
溶解性有机碳
溶液中有机碳的含量，通常指通过0.45μm滤膜过滤后液体中的有机碳含量，或经4000r/min转速离心15min后上清液中的有机碳含量。2.4
生化需氧量biochemicaloxygendemand，BOD微生物分解有机物所消耗氧的量，可表示为每旁克受试物消耗的氧气癌克数（mg/mg）。2.5
chemicaloxygendemand,COD
化学需氧量
在强酸并加热条件下，一定量的重铬酸盐氧化水样中还原性物质所消耗氧化剂的量，可表示为每癌克受试物消耗的氧毫克数(mg/mg）。2.6
理论需氧量
theoretical oxygen demand,ThOD根据分子式计算得到的受试物完全被氧化需要的氧的总量，可表示为每寒克受试物消耗的氮气寒克数（mg/mg）。
停滞期lagphase
试验开始到降解率达到10%的时期。2.8
十天观察期10-dwindow
生物降解率达到10%之后的10d试验时间。2.9
降解期degradationphase
停滞期结束到降解率达到最大降解率的90%的时期。1
GB/T21801—2008
3受试物信息
分子式；
水中溶解度；
蒸气压；
d）结构式；
e）纯度；
主要成分组成比例；
吸附性；
微生物毒性。
4方法概述
4.1原理
向一定体积并已接种的家/机物培养基中加人适量受试物（100mg/L受试物至少预留50mg/L~100mg/L的理论需氧量)作为唯一的有机碳源，密闭烧瓶后在恒温下(变化小于土c)连续搅拌28d。通过测定为维持呼吸烧瓶内气压而电解产生氧气的量，或者用仪器测定瓶内气体体积或压力（或二者）的变化，可得到耗氧量。释放的二氧化碳用氢氧化钾溶液或其他适当的吸收剂啵收。在受试物生物降解的过程中（用平待试验中的空白接种物的摄人来校正），微生物种群吸收氧的量以THOD的百分率来表示，或用效果略差的OD来表示，另外，通过化学分析测定试验开始和结束时受试物浓度，可以确定受试物的初级生物降解性。通过DOC分析，可以确定受试物的最终生物降解率4.2参比物
本标准推荐举胺（薪蒸馏）、醋酸钠或苯甲酸钠作为参比物。若使用其他参比物，试验报告中应加以说明。
5试验准备
5.1设备
a）呼吸计；
b）温度控制器（
c）膜过滤器；
d）碳分析仪。
5.2接种物
5.2.1接种物选择
接种物可以有多种来源：活性污泥、污水、地表水和土壤，或以上几种的混合物。5.2.2活性污泥接种物
活性污泥采自污水处理厂或主要处理生活污水的中试规模的处理装置曝气池中的新鲜样品，并保持有氧状态。在通过细过滤网去除粗糙的颗粒后，沉淀或离心分离（如：1100g，离心10min)将浮在表面上的杂质除去。污泥可用试验培养基进行清洗，使活性污泥在试验培养基中质量浓度为3g/L5g/L，保持有氧培养直至使用。
当污泥中可能含有抑制剂时，应清洗。将污泥与试验培养基充分混合后沉淀或离心分离后再悬浮，去掉悬浮物，再用试验培养基悬浮洗过的污泥。重复这一操作直到污泥中认为不含酶和抑制剂。试验前从悬浮污泥中抽取一份样品，确定活性污泥的干重。也可用匀浆器以中等速度将活性污泥搅拌2min，使其均质化(3g/L～5g/L），沉淀30min或更长（如有需要），与试验培养基按大约10mL/L的比率，轻轻倒出液体作为接种物。5.2.3其他来源的接种物
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接种物也可采自污水处理厂或主要处理生活污水的中试装置的二级出水。采集一个新鲜样品并在运输中保持有氧状态。样品沉淀1h或用粗滤纸过滤后，保持上清液或滤出液在有氧状态直至使用。每升培养基可添加100mL该接种物。接种物的另一个来源是地表水。收集一份地表水样品，如河水、湖水并保持有氧状态直至使用。如有必要，可通过过滤器或离心将接种物浓缩。5.2.4接种物的预处理
接种物可在试验条件下预处理，但不是对受试物的预驯化。预处理包括在试验培养基（不添加受试物)中对活性污泥或在试验温度下对二级出水曝气培养5d～7d。5.3试验用水
为避免较高空白值，应使用去除毒性物质（如Cu2+）的高纯度去离子水或蒸馏水，确保有机碳含量小于或等于受试物浓度的10%，对于每组系列试验使用同一批水。5.4培养基
5.4.1培养基贮备液
用分析纯试剂配制下列贮备液：a）磷酸缓冲液：称取8.50g磷酸二氢钾（KH2PO,）、21.75g磷酸氢二钾（KzHPO,）、33.40g二水合磷酸氢二钠（NazHPO·2H2O)和0.5g氯化铵（NH,CI)，用水溶解，定容至1L，pH为7.4。
氯化钙溶液：称取27.50g无水氯化钙（CaCl2）或36.40g二水合氯化钙（CaCl2·2H2O），用水溶解，定容至1L。
硫酸镁溶液：称取22.50g七水合硫酸镁（MgSO·7HzO)，用水溶解，定容至1L。氯化铁溶液：称取0.25g六水合氯化铁（FcCls·6H2O)，用水溶解，定容至1L。加人d)
0.05mL浓盐酸或0.4g/LEDTA二钠盐缓冲溶液保存。上述贮备液中如果出现沉淀，则需重新配制。5.4.2试验培养基的制备
将10mL磷酸缓冲液加800mL蒸馏水，再加氯化钙溶液、硫酸镁溶液和氯化铁溶液各1mL，加燃馏水定容至1L。
6试验程序
6.1组别设计
a）通常，试验中需要设置下列组别：一含受试物和接种物的试验组（两个烧瓶平行）；一仅含接种物的接种物空白对照组（两个烧瓶平行）；一含参比物和接种物的程序对照组。b）必要时：
—一含受试物和消毒剂的无菌消毒对照组；一含受试物、接种物和消毒剂的吸附对照组：一含受试物、参比物和接种物的性对照组（见附录A）。6.2受试物购备液
受试物或参比物的水中溶解度若超过1g/L，则称取1g～10g，用试验用水溶解并定容至1L。否则，将受试物直接加人试验培养基中，确保受试物溶液均质化。6.3烧瓶的准备
在试验培养基中用贮备液分别配制受试物和参比物溶液，一般浓度为100mg/L受试物（50mg/L～3
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100mg/LThOD)。应按形成铵盐的方法计算ThOD，但如果有硝化作用发生时，应根据硝酸盐的形成来计算（见附录C)。确定pH值，必要时调整到7.4士0.2。试验组和空白对照组至少设两个平行。如果受试物具有毒性，则增加毒性对照组，同时加入受试物和参比物，浓度与前相同。如果需测定非生物降解，则增加非生物消毒对照组，通常浓度为100mg/LThOD.
如果受试物是难溶解物质，根据重量或体积或如附录B中所述方式在此阶段直接加人受试物。向二氮化碳吸收单元，加人氢氧化钾、碱石灰或其他吸收剂。6.4试验操作
烧瓶达到适合的温度，加入适量的接种物，悬浮固体浓度不大于30mg/L。密闭烧瓶，开启搅拌器，检查气密性，开始测定氧吸收的量。在试验中，定期读取足够的数据，易于十天观察期的识别。每日检查试验系统，保证温度正确和搅拌充分。在试验结束时，一般是28d，测定烧瓶内溶液的pH。如果是含氮化学品，氧吸收量低于或高于按形成铵盐的方法计算的ThOD，必须测定。需要时，在试验开始和结束时从呼吸烧瓶中采样测定DOC或做特定化学物质分析（见附录C)。在试验开始时采样后应确保留在烧瓶中的受试悬浮液的体积是已知的。当含氮受试物吸收氧时，28d后应测定亚硝酸盐和硝酸盐浓度增加量，以计算硝化作用的氧消耗(见附录D)。质量保证与质量控制
a）在稳定期、试验结束时或十天观察期结束时，平行试验间的降解率最大差别应低于20%：试验进行到第14天时，参比物程序对照的降解率以DOC计不低于70%、以ThOD计不低b)
于60%；
接种物空白对照组的氧消耗通常在20mg/L～30mg/L（以O，计）；28d试验期间，氧消耗c)
不大于60mg/L(以0，计)。若氟消耗量大于60mg/L，应复查；d）若pH值超出6～8.5范围，且受试物氧消耗量小于60%，应设置较低的受试物浓度，重新试验。
8数据与报告
数据处理
首先用受试物氧吸收量除以受试物重量并经接种空白对照校正来计算各时段的每毫克受试物的氧消耗量（BOD）（mg/mg），见式（1)：BOD=abm
式中：
a受试物氧消耗量，单位为旁克(mg)bm-空白对照试验氧消耗量平均值，单位为旁克(mg)；C。一—介质中的起始浓度，单位为毫克每升(mg/L)；V进行试验的反应液体积，单位为升(L)。生物降解百分率可从式(2)或式(3)中获得：BOD
式中：
D——生物降解率，%。
con×100wwW.bzxz.Net
........(1)
ThOD和COD的计算和确定见附录C。注意这两种方法可能得到不同的降解率，本标准推荐使用前者。当测定特定受试物或DOC时，降解百分率计算见式(4)：C-Cura × 100
式中：
D,——t时刻的降解百分率，%;
C。-CH(e)
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·（4）
C。一一含受试物和接种物的试验组的初始DOC浓度，单位为衰克每升(mg/L)；C,一一含受试物和接种物的试验组t时刻的DOC浓度，单位为旁克每升(mg/L)；Cblko)——空白对照组的初始DOC浓度，单位为旁克每升(mg/L)；Chlca——t时刻空白对照组的DOC浓度，单位为毫克每升(mg/L)。所有浓度在试验中测定得到。
当受试物含氮时，根据已知或估计出现的硝化作用选择使用适当的ThOD(NH或NO：）。如果硝化作用不完全，可根据28d试验期的硝酸根和亚硝酸根浓度校正硝化作用的氧消耗（见附录D)。8.2结果报告
试验报告应包括以下内容：
a）受试物：
分子式等基本信息；
物理属性，及基本理化性质；
鉴定信息；
样品保存条件等。
b）试验条件：
接种物：状态和取样地点，浓度和预处理方式；-污水中工业废水的比例和状况(若已知)；试验周期与温度；
受试物溶液/悬浮液制备方法；
程序改变的原因及解释说明。
结果：
将数据填入“数据表”(见附录E)；任何观察到的抑制现象；
任何观察到的非生物降解；
一特定化学物质分析数据（若适用）；受试物降解产物的分析数据（若适用）；受试物及参比物的降解曲线，包括停滞期、降解期和十天观察期；稳定期、试验结束时和(或)十天观察期结束时的降解率。d）结果讨论。
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附录A
（资料性附录）
受试物对接种物生长抑制作用的处理若同时含有受试物和参比物的毒性对照组14d内以DOC计降解率低于35%，则可认为受试物对接种物有抑制作用，试验时应设置较低的受试物浓度，和(或）较高浓度的接种物（但不大于30mg/L)。当快速生物降解试验中受试物表现为无生物降解性时，为判别是源于受试物对接种物的抑制作用还是因为受试物的惰性，推荐采用以下措施：微生物毒性试验和生物降解试验采用类似或相同的接种物；微生物毒性试验可以单独或联合采用以下方法：活性污泥呼吸抑制试验、BOD和（或）微生物生长抑制试验；
生物降解性试验中，为避免受试物抑制接种物的活性，建议受试物浓度设置为ECso的1/10（或低于EC2o）。若受试物对接种物的ECso>300mg/L时，可判定受试物对接种物无抑制影响；当受试物对接种物的ECso<20mg/L时，应设置较低的受试物浓度。推荐采用密闭瓶法试验或使用\C标记材料评价生物降解性；若采用经受试物驯化的接种物，试验时可设置较高的受试物浓度，但试验结果不能用于评价快速生物降解性。6
附录B
(资料性附录）
难溶性受试物的处理
对于难溶于水的受试物的生物降解性试验，应特别注意以下问题：GB/T21801—2008
鉴于均质的液体很少有采样问题，因此应采用适当的方法使固体物质均质化，避免非均质造成的误差。当需要从混合物或含大量杂质的受试物中采集几毫克的代表样品时，尤其应特别小心；试验过程中可采用多种搅拌方式，要注意搅拌到足以使受试物分散、但又不致于出现过热、泡沫过多或过强的分散力；
可使用乳化剂使受试物呈稳定的分散状态，但乳化剂在试验条件下应对接种物无毒、不降解，也不起泡；
对溶剂的要求同乳化剂
对于固体受试物，乳化剂不得属于固体载运剂，但油性受试物可以使用载运剂；当使用辅助物质如乳化剂、溶剂和毂运剂时，应设量辅助物质空白对照西
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