【国家标准(GB)】 动物源食品中激素多残留检测方法 液相色谱-质谱/质谱法

ICS 67. 120
中华人民共和国国家标准
GB/T21981—2008
动物源食品中激素多残留检测方法液相色谱-质谱/质谱法
Determination of hormone multiresidues in foodstuffs ofanimal origin--LC-Ms/MS method2008-06-06发布
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中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中国国家标准化管理委员会
2008-07-03实施
GB/T21981--2008
本标准附录A和附录B为规范性附录，附录C、附录D、附录E、附录F和附录G均为资料性附录。本标准由中华人民共利国国家质量监督检验检疫总局提出。本标准由中华人民共和国国家认证认可监督管理委员会归口。本标准起草单位：北京市疾病预防控制中心，中国疾病预防控制中心营养与食品安全所，中国检验检疫科学研究院。
本标准主要起草人：邵兵、杨爽、张晶，吴永宁、储晓刚。1范围
动物源食品中激素多残留检测方法液相色谱-质谱/质谱法
本标准规定了动物源食品中激素残留量的液相色谱-质谱/质谱测定方法。GB/T 21981—2008
本标准适用于猪肉、猪肝、鸡蛋、牛奶、牛肉、鸡肉和虾等动物源食品中50种激素（见附录A)残留的确证和定意测定。
2 规范性引用文件
下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标，然而：鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最版本，凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标推。GB/T6682分析实验案用水规格和试验方法（GB/T6682—1992neq1SO3696：1987）3方法提要
试样中的目标化合物经哟质，酶解，用甲醇-水溶液提取，经相萃取富集净化，液相色谱-质谱/质谱仪测定，内标法定量。
试剂和树料
除特殊注明外，本标推所用试剂均为色谱纯，水为GB/T6682规定的一级水。4、1甲醇，
4.2二氮年烷。
4.3 乙腩。
4.4甲酸。
4.5乙酸：分析纯，
4.6乙酸钠(NaAC·4HI,O):分析纯。4.7β-葡萄糖醛酸酶/芳香基硫酸酯酶溶液（8-glucuronidasc/arylsulfatase）：4.5U/mLβ葡萄糖醛酸酶，l4 U/ml.芳香基硫酸酶，
4.8乙酸-乙酸钠缓冲溶液（pH5.2)：称取43.0g乙酸钠（NaAC4H,O），加人22mI乙酸，用水溶解并定容到1000mL，用乙酸调节pH到5.2.4.9甲醇-水溶液（1+1，体积比）：取50mL甲醇和50mL水混合。4.10二氯甲烷-醇溶液（7十3体积比）：取70mL二氯甲烷和30mL甲醇混合。4.110.1%甲酸水溶液：精确量取甲酸1mL加水稀释至1000mL。4、12标准品：去甲雄烯二酮、群勃龙、勃地酮、氟甲翠酮、诺龙、雄烯二酮、率酮、普拉雄酮、甲睾酮、异睾酮、表雄酮、康力龙、173羟基雄烷-3-酮、美睾酮、达那唑、美雄诺龙、羟甲雄烯二酮、美雄醇、雄二醇、雌三醇、雌酮，炔雌醇、已烷雌酚、己烯雌酚、已二烯雌酚、炔诺酮、21a-羟基孕酮、17a-羟基孕酮、左炔诺孕酮、甲羟孕酮、乙酸甲地孕丽、孕酮、甲羟孕酮乙酸酯、乙酸氣地孕酮、曲安西龙、醛固酮、泼尼松、可的松、氢化可的松、泼尼松龙、氟米松、地塞米松、乙酸氟氢可的松、甲基泼尼松龙、倍氯米松、曲安奈德、氟轻松、氟米龙、布地奈德、丙酸氮倍他索，纯度均大于97%。物质英文名称及CAS号见附录A。1
GB/T 21981—2008
4.13同位素内标：炔诺孕酮-d,孕酮-d，、甲地孕酮乙酸酯-d、甲羟孕酮-d:美仑孕酮-d，.炔诺酮-13C2氯睾酮乙酸酯-ds，氯睾酮-d，、16β羟基司坦唑醇-d，、甲睾阐-d、勃地龙-d、氢化可的松-ds、睾酮-13Cz、雌酮-dz雌二醇-\Cz、α烯雌酚-d、色二烯酚-d，已烷雌酚-d，物质英文名称见附录 B。4.14标准储备液：分别准确称取10.0 mg的标准品及内标于10 ml.容量瓶中，用甲醇溶解并定容室刻度制成1.0mg/mL标准储备液，一18C以下保存，标准储备液在12个月内稳定。4. 15混合内标工作液：用甲醇将各标准储备溶液配制成浓度为100 μg/L的混合内标工作液。4.16混合标准工作液：根据需要，用甲醇-水溶液（4.9)将各标准储备溶液配制为适当浓度(0.5,1,2，5,10,20 和 40 μg/L,其中炔诺酮、表雄酮,布地奈德、17β羟基雄烷-3-酮、氟米龙氟甲睾酮为其他化合物浓度的5倍），标准工作溶液中含各内标浓度为10μg/L。4.17ENVI-Carb周相萃取柱（500mg，6mL）或相当者，使用前依次用6mL二氯甲烷-甲醇溶液(4. 10),6 mL 甲醇、6 mL 水活化,4. 18 氨基固相落取柱(500 mg,6 mL),使用前用 6 mL 二氮甲烷-甲醇溶液(4. 10)活化。5仪器
液相色谱-串联四极杆质谱仪：配有电喷雾离子源。电子天平：感量为0.0001g和0.01g。5.2
组织与浆机。
涡旋混合器。
5.5恒温振荡器。.
超声清洗役。
离心机：10 000r/min。
周相苯取装置。
氨吹仪。
pH计。
5.11移液器。
6试样制备
动物肌肉、肝脏、虾
从所取全部样品中取出有代表性样品约500B，慰除筋膜，虾去除头和壳。用组织揭碎机充分捣碎均匀，均分成两份，分别装人洁净容器中，密封，并标明标记，于一18℃以下冷冻存放。6.2牛奶
从所取全部样品中取出有代表性样品约500名，充分摇勾，均分成两份，分别装人洁净容器中，密封，并标明标记，于0℃～4℃以下冷存放。6.3鸡蛋
从所取全部样品中取出有代表性样品约500g，去壳后用组织捣碎机充分搅拌均匀，均分成两份，分别装人洁净容器中，密封，并标明标记，于0℃～4℃以下冷藏存放。注：制样操作过程中应防止样品被污染或其中的残留物发生变化。7分析步骤
7.1提取
称取 5g试样(精确至0.01 g)于 50 mL具塞塑料离心管中,准确加入内标溶液(4.15)100 μL和10mL乙酸-乙酸钠缓冲溶液（4.8），涡旋混匀，再加人β葡萄糖醛酸酶/芳香基硫酸酯酶溶液100μL，于37℃士1℃振荡酶解 12 h。取出羚却至室褪，加人 25 rnL 甲超声提取 30 min，0℃ ～4℃下2
10000r/min离心10min。将上清液转人洁净烧杯，加水100mL，混匀后待净化。7.2化
GB/T 21981--2008
提取液(7.1)以2mL/min~3mL/min的速度上样于活化过的ENVl-Carb固相萃取柱(4.17)。将小柱减压抽干。再将活化好的氨基柱申接在 ENVI-Carb 周相萃取柱下方。 用 6 mL 二氮甲烷-甲醇溶液（4.10)洗脱并收集洗脱液，取下ENV1-Carb小柱，再用2mL二甲烷-甲醇溶液（4.10)洗氮基柱.洗脱液在微弱的氮气流下吹干，用1mL甲醇-水溶液（4.9)溶解残渣，供仪器测定。8测定
8.1雄激素、孕激素、皮质醇激素测定8.1.1液相色谱条件
a） 色谱柱:ACQUITY UPLCTM BEH C柱,2. 1 mm(内径)X100 mm，1.7 μm,或相当者。b）流动相：A,0.1%甲酸水溶液(4.11)B,甲醇。梯度淋洗，参考梯度条件参见表C.1。c）流速：0.3mL/min。
d）柱温：40℃，
e）进样量：10μL。
8.1.2雄激素，孕激素测定参考质谱条件a）电离源：电喷雾正离子模式，b）毛纽管电压:3.5kV
源温度：100℃
脱溶剂气温度：450℃。
脱溶剂气流量：700L/h，
碰室压力:0.31 Pa(3.1×10-mbar)。R）雄激素、孕激索的特征离子参见丧 D.1和衰 D,2。8.1.3皮质募激素测定参考质谱条件2）电离源：电喷雾负离子模式。b）毛细管电压:3.0 kV.
源温度：100℃。
d）脱溶剂气温度：450℃。
脱溶剂气流量:700 L/h。
f)碰撞室压力：0.31Pa(3.1x10-3mbar)。g）皮质醇激素的特征离子参见表D.3。8.2
雌激素测定
8.2.1雌激素测定液相色谱条件
色谱柱：ACQUITYUFLCtMBEHCa柱，2.1mm(内径）×100mm，1.？μm,或相当者。流动相:A,水;B,乙睛。梯度洗脱,参考梯度条件参见表 C. 2。b）
流速:0.3 mL/min.bZxz.net
d）柱温;40℃。
e）进样量：10 μl.。
8.2.2雌激素测定质谱条件
a）电离源：电喷筹负高子模式。b）毛细管电压：3.0 kV，
c）源温度：100℃。
d）脱溶剂气温度：450℃。
GB/T 21981--2008
脱溶剂气流量700 L/h。
f)碰撞室压力：0.31Pa(3.1×10-mbar)。g）雌激素的特征离子参见表 D.4。9定性
各测定目标化合物的定性以保留时间和与两对离子(特征离子对/定昼离子对)所对应的 LC-MS/MS色谱峰相对丰度进行。要求被测试样中标化合物的保留时间与标准落液中目标化合物的保留时间-致,同时被测试样中目标化合物的两对离了对应的LC-MS/MS色谱峰丰度比与标准溶液中目标化合物的色谱峰丰度比一致，允许的偏差见表1。表1定性定时相对离子丰度的最大充许偏差相对离子丰度
允许的相对偏差
10定量
>20%至50%
本标准采用内标法定量。各物质对应内标见表A.1。>10%至20%
每次测定前配制标准系列（4，14），按浓度也小到大的顺序，依次上机测定，得到同标翻滋度与峰面积比的工作曲线。标溶液的液相色谱-质谱/质谱多反应监测(MRM)色谱图参见图E.1。11计算
按式(1)计算试样中检测目标物残留量（μg/kg）：X,=XV
式中：
X，—试样中检测目标化合物残留量，单位为微克每千克（μg/kg)cs—-由回归曲线计算得到的上机试样溶液中目标化合物含量，单位为微克每升(μg/L)V浓缩至-后试样的定容体积，单位为毫升（mL）；m-试样的质量，单位为克（g）。12测定低限和回收率
按能够难确确认的目标化合物排度来估计各目标化合物在不同样品基质的检限,样品基质、取样量、进样量，色谱分离状况，电噪卢水平以及仪器灵敏度均可能对样品检出限造成影响，因此噪声水平应从实际样品谱图中获取。当某目标化台物的结果报告末检出时应同时报告样品检出限。采用上述方法,50种激素在不同基质中的测定低限为0.4/kg~～2. 0μ/kg(参见表F.1)。各化合物的加标回收率在 75. 2%～121. 8%之间,相对标推偏差为 2. 4%～20. 8%(参见表 G.1 和表 G. 2)。化合物
去甲雄烯二酮
群勃龙
勃地嗣
氟甲睾酮
雄烯二副
美雄酶
异睾弱
英雄醇
袁端酮
原力龙
173羟基雄烷·3酮
美翠丽
达那唑
美雄诺龙
炔诺酮
21-羟基孕酮
17-羟基孕酮
甲基炔器
甲羟孕酶
乙酸甲地孕阐
乙酸氨地孕酮
甲羟孕乙胶酯
曲安西龙
醛固酮
筱尼松
可的松
附录A
（规范性附录）
50种激素物质的英文名称、CAS号及对应的内标物质裹A.1
50种激案物质的英文名称、CAS号及对应的内标物质英文名
19-nor-4-androstene-3,17-dionetrenbolone
bolderane
floxyriesterone
nandrolone
4-androstene-3,17-dionc
methandroslenolone
lustaslerone
Cehydroepiandrosterore
rethyltestcsterone
testastrcne
nethylandros tenediol
epiandrcsrerane
tang2olal
S andrpsten.17p-ol 3-nne
mesterolane
dlanazot
mestanolane
19-narethindrone
2la-hydroxyprogesterone
17a-hydraxyprogesterone
D-(-)-norgestrel
mcdroxyprogusterone
mtgestrol acelulc
chlormadinone acetate
progesterone
medroxyprogesterone
triamcinolone
aldosterone
Prednisone
cartisone
CAS号
734-32-7
10161-33-8
846-48-0
76-43-7
434-22-0
734-32-7
72-63-9
58-22-0
53-43-0
5858-18-4
521 10-8
10418-03-8
521-18-5
1424-00-6
17230-88-5
521-11-9
68-22-4
61-85-7
68-96-2
797-63-7
520-85-4
595-33-5
302-22-7
57-83-0
71-58-9
124-94-7
52-39-1
53-03-2
53-06-5
GB/T21981—2008
内标物质
勃地酶-d
勃地-d
勃地愿-d
勃地-d
勃地-d
粤酮-1Ce
睾酮-1aC
睾酮-1aC
翠酮-Ca
翠丽-13C2
甲率南-d,
甲率丽-d,
16.9-羟基司步噬醇·2:
氮率雨-d，
氟案酶-d
氣睾酮艺酸酯·da
氯睾两乙酸酯-da
焕诺酮-\C
美仑孕-d
美仑孕酮-d
炔诺孕酮-da
甲羟孕酮-d
甲地孕酮乙酸酯-山
甲地孕酮乙酸酯-山
孕酮-d
甲地孕阴乙酸酯-d
氢化可的松-d
氢化可的松-d
氢化可的松-d，
氢化可的松-d
GB/T 21981—2008
化合物
氢化可的松
浚尼松龙
氟米松
地塞米松
乙酸氯氢可的松
甲基泼尼松龙
猎氣米松
曲安奈德
氟轻松
氟米龙
布地奈德
丙酸氣倍他索
雌三醇
雌二醇
炔雌醇
已烯雌酚
已烷雌龄
已二烯雌酸
cortisol
表A.1（续）
英文名
prednisolone
flumethasone
dexanethasone
fludro cortisone acetate
methylprednisolone
beclomethasone
trismcinolone aretonide
fluocinolane acetonide
fluoriretholone
budesonide
clobetasol propionate
estradiol
estriol
ethinylestradiol
estrone
diethylstilbestrol
hexestrol
dienestrol
CAS号
50-23-7
50 24-8
2135-17-3
50·02-2
514 36-3
83-43-2
4419-39-0
76-25-5
67-73-2
426-13-1
51333-22-3
25122-46-7
50-27-1
50-28-2
57-63-6
53-16-7
6898-57-1
84-15-2
84-17-3
内标物质
氢化可的松-d
氢化可的松-d
氢化可的松山
氢化可的松-d
氢化可的松-d；
氢化可的松-d；
氢化可的松-d
氢化可的松-d
氢化可的松-d
氢化可的松-d
氢化可的松-d
氢化可的松-ds
唯二醇-\C
雌二醇-\C2
维-da
雌·2
己烯雌酚-2
己二烯虽-d
已烷雌酸d
炔诺孕酮-d;
孕酶-d
甲地孕乙酸-d
甲羟孕酮-d
美仑孕葡-d
炔诺酮-13C2
氧酮乙酸能-d
16羟基司坦噬-d
软地酶-d,
氢化可的松-d
雞二醇C
己烯雌酚-αs
己二烯雌酚-2
已烷雎份-d
化合物
附录B
（规范性附录）
18种内标物质的英文名称
表 B, 118 种内标物质的英文名称norgestrel-da
progesterone-d
megestrol-ct acetate
英文名
medroxyprogesteroned
melengcsirol-d
nurthindrune-ethynyl-\C.
ciloriestosterone acetaled
chlortestostercr.e-cs
16p-hydrcxy-staaozotal d.
methyltestcsterone-da
17g boldenoned,
cortiwol-d,
Testostercne-3, 1-'C
estrore-2,4-d.
estrac;cl-3,1-\c.
ciethylstilbesiroi-ds
dienestrot-d:
hexestrcl-d.
GB/T 21981-2008
GB/T 21981—2008
时闻/min
时间/min
附录C
(资料性附录）
参考液柏色谱条件
表C.1雄激素、孕激素、皮质醇激素参考液相色谱条件A/%
雕激素参考液相色谱条件
化合物
去甲雄烯二
群勃龙
氟甲睾酮
塔烯一霸
美雄丽
普拉雄
异睾菊
美雄醇
表雄丽
康力龙
17羟基雄烷-3 酮
美率酮
附录D
(资料性附录）
参考质谱条件1
表 D.1雄激素参考质谱条件
保留时间/
母离子
锥孔电压/
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子离子
碰撞能母
非商业性声明：附录D所列参考质谱条件是在Micromass-QuattroPremierXE质讲仪上完成的，此处列出试验1
用仪器型号仅为提供参考，并不涉及商业目的鼓励标难使用者尝试不同厂家载型号的仅累。9
GB/T 21981--2008
化合物
美肇诺龙
氣率酮乙酸酯-d
16-羟基司坦唑醇-dg
甲翠酮-ds
勒地酮d
睾酮C
保留时间/
表D.1（续）
母离子
雄孔电压/
注：对不同质谱仪器，仪器参数可能有在差异，测定前应将质谱参数优化到最佳。。为定量离子。
化合物
炔诺酮
21-羟基孕南
17a尧基孕丽
甲基诺酮
甲羟孕酮
乙甲地孕酮
乙酸氛地孕酮
甲轻孕酮乙酸酯
炔诺举-
李-d，
伊地孕弱乙酸酯-d
甲羟孕酮-d
美仑孕酮-da
炔诺酮-C
保留时间/
. 8.99
孕激素参考康谱亲件
母离子
锥孔电压/
往：对不间质谱仪器，仪器参数可能存在范异，测定前应将质谱参数优化到最佳。为母离子。
子离子
(ru/2)
子离子
碰撞能量/
碰撞能能/
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