【地方标准】 牛病毒性腹泻/粘膜病病毒荧光RT-PCR检测方法

本标准规定了牛病毒性腹泻/粘膜病病毒（BVDv）荧光RT-PCR检测方法。本标准适用于牛病毒性腹泻/粘膜病病毒的检测。本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草，由吉林出入境检验检疫局提出并归口，起草单位为吉林出入境检验检疫局技术中心。主要起草人包括孟庆峰、王伟利、吴连鹏、王玮琳、肖成蕊、蔡阳、宋战昀、孟日增。标准编号为DB22/T1608-2012。 1 范围 本标准规定了牛病毒性腹泻/粘膜病病毒（BVDv）荧光RT-PCR检测方法。适用于牛病毒性腹泻/粘膜病病毒的检测。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T6682 分析实验室用水规格和试验方法。 3 缩略语 下列缩略语适用于本文件： Ct值：达到阈值的循环数（Cycle Threshold） DEPC：焦碳酸乙酯（Diethyl pyrocarbonate） Tag酶：Taq DNA聚合酶（Taq DNA polymerase） RNA：核糖核酸（Ribonucleic Acid） 荧光RT-PCR：荧光逆转录聚合酶链反应（Real-Time Fluorescent Quantitative Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction） 4 原理 采用TaqMan方法，比对牛病毒性腹泻/粘膜病病毒基因组5'端非编码区最保守的核苷酸序列，设计特异性引物和特异性的荧光双标记探针进行配对。探针5'端标记FAM荧光素为报告荧光基团，3'端标记TAMRA荧光素为灭荧光基团。PCR反应进入退火阶段时，引物和探针同时与目的基因片段结合，探针上的R基团发出的荧光信号被Q基团吸收，仪器检测不到荧光信号。随着反应进入延伸阶段，Taq酶的外切核酸酶功能将探针降解，R基团游离出来并发出荧光信号，仪器可以接收到该信号，从而实现定量检测。 5 试剂和材料 除非另有说明，本方法所用试剂均为分析纯，水为GB/T6682规定的一级水。所有试剂均用无RNA酶的容器分装。