【地方标准】 大白菜芜菁花叶病毒、黄瓜花叶病毒检测技术规程

DB37/T3894—2020
大白菜芜菁花叶病毒、黄瓜花叶病毒检测技术规程
Detection and identification of turnip mosaic virus and cucumber mosaic virus in Chinese cabbage

前言
本标准按GB/T 1.1-2009给出的规则起草。本标准由山东省农业农村厅提出并组织实施。本标准由山东省农业标准化技术委员会归口。本标准起草单位：山东省农业科学院植物保护研究所。本标准主要起草人：吴斌、辛相启、王升吉、姜珊珊、张眉、辛志梅。

1 范围
本标准规定了大白菜中芜菁花叶病毒、黄瓜花叶病毒的间接ELISA、Dot-ELISA和普通RT-PCR检测方法。
本标准适用于山东省芜菁花叶病毒、黄瓜花叶病毒在传播介体蚜虫和大白菜中的检测。

2 规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。
GB/T 6682-2008 分析实验室用水规格和试验方法

3 样品采集与保存
3.1 蚜虫样品采集
在蚜虫盛发初期进行蚜虫样品采集，于白菜田、周边蔬菜田或田间杂草丛等蚜虫喜好栖息环境，采用直径33cm的35目纱网在田间随机进行扫扑，分装入试剂瓶中，用100%乙醇浸泡，并在-20℃以下冰箱保存备用。
3.2 叶片样品采集
采集表现TuMV和CMV花叶、皱缩、植株矮化、畸形等典型症状的大白菜叶片5g～10g，单株样品袋存放。样品采集后，在冷藏条件下（2℃～8℃）运送至实验室。如果样品在2天内检测，可暂时储存于2℃～8℃冷藏箱；如果样品在2天以后检测，保存至-80℃超低温冰箱备用，样品应避免反复冻融。

4 主要仪器设备、用具和试剂
4.1 仪器设备
仪器设备主要有：
a) 酶标仪；
b) 洗板机；
c) 电子天平（感量0.001g）；
d) PCR仪；
e) 电泳仪；
f) 水平电泳槽；
g) 凝胶成像仪；
h) 高速冷冻离心机；
i) 水浴锅；
j) 样品冷藏柜；
k) 低温冰箱（-20℃）；
l) 超低温冰箱（-80℃）；
m) 磁力搅拌器；
n) 高压灭菌锅；
o) 可调微量移液器（10μL、100μL、200μL、1000μL）。

4.2 用具
用具主要有：
a) 无RNase吸头（10μL、100μL、200μL、1000μL）；
b) 酶标板；
c) 硝酸纤维素膜（NC膜）；
d) 无RNase离心管；
e) PCR反应管；
f) 研钵；
g) 样品袋；
h) 标签；
i) 镊子。

4.3 主要试剂
TuMV抗体、CMV抗体、酶标二抗、TuMV特异性引物、CMV特异性引物、TriZol、液氮、三氯甲烷、异丙醇、乙醇、M-MLV RT反转录酶、RNA酶抑制剂、Taq DNA聚合酶、DNA分子标记、GelRed、琼脂糖等。除特殊说明外，所有实验用试剂级别均为分析纯级。试验用水为无菌超纯水或去离子水，均符合GB/T 6682-2008。血清学和分子生物学检测试剂配制见附录A。

5 检测
5.1 方法提要
芜菁花叶病毒、黄瓜花叶病毒的血清学特性与分子生物学特性是该病毒检测方法的主要依据。两种病毒都具有很强的免疫原性，同时都是RNA病毒，因此可利用间接ELISA、Dot-ELISA和RT-PCR方法确定样品中是否带有上述两种病毒。
5.2 间接酶联免疫吸附测定
5.2.1 样品制备
将单头蚜虫置于小型离心管内，加300μL包被缓冲液研碎，4℃冰箱放置1~6h；称取待测植株样品0.1g以上，按1:10（质量:体积）加入包被缓冲液，用研钵研磨成浆，4℃冰箱放置1h～5h。将两类研磨液在8000r/min下离心3min，上清液即为制备好的检测样品。设阴性对照和阳性对照，阴性对照样品为试验室保存的未感染病毒的健康大白菜叶片，阳性样品为试验室保存的感染TuMV或CMV的标准样品，阴性样品及阳性样品皆通过RT-PCR检测及测序验证。阴性对照、阳性对照作相同的处理，样品提取缓冲液作空白对照。
5.2.2 加样
在酶标板上加入制备好的待检测样品、阴性对照、阳性对照、空白对照，每个样品平行加到两个孔中，每孔加样100μL，加盖，4℃冰箱孵育12h~16h。
5.2.3 洗板
孵育结束后，用PBST清洗酶标板3次～5次。每孔每次加PBST洗液700μL，每次停留1min～2min。
5.2.4 加抗血清
用抗体稀释缓冲液按照相应病毒抗血清的使用浓度进行稀释，每孔加入稀释好的抗体液100μL，加盖，37℃孵育1.5h。
5.2.5 洗板
同5.2.3。
5.2.6 加酶标抗体
用抗体稀释缓冲液将酶标抗体稀释至工作浓度，并加入到酶联板中，100μL/孔，加盖，37℃孵育1.5h。
5.2.7 洗板
同5.2.3。
5.2.8 加底物缓冲液
将现配的底物缓冲液按100μL/孔，加入到酶联板中，室温避光孵育1h。
5.2.8.1 读数
每孔加100μL 3 mol/L NaOH终止剂终止反应，用酶标仪在405nm波长下测定各孔的吸光值（OD）。
5.3 斑点酶联免疫吸附测定
5.3.1 NC膜制备
裁剪7cm×7cm大小的NC膜，用铅笔在保护纸外划成7mm×7mm大小的方格，划好后去掉保护纸备用。
5.3.2 样品制备
将单头蚜虫置于小型离心管内，加30μL PBS磷酸盐缓冲液研碎；称取待测植株样品0.1g以上，按1:10（质量:体积）加入PBS磷酸盐缓冲液，用研钵研磨成浆，将两类研磨液在8000r/min下离心3min，上清液即为制备好的检测样品。设阴性对照和阳性对照，阴性对照样品为试验室保存的未感病毒的健康大白菜叶片，阳性样品为试验室保存的感染TuMV或CMV的标准样品，阴性样品及阳性样品皆通过RT-PCR检测及测序验证。阴性对照、阳性对照作相同的处理，样品提取缓冲液作空白对照。
5.3.3 加样
分别取2μL制备好的待检测样品、阴性对照、阳性对照、空白对照，点到NC膜的相应格子中，室温干燥10min。每个样品平行在膜上重复一次。
5.3.4 封闭