【地方标准】 茄果类蔬菜种苗番茄黄化曲叶病毒检测技术规程

DB12/T1007—2020
茄果类蔬菜种苗番茄黄化曲叶病毒检测技术规程
Technical regulation of detection for tomato yellow leaf curl virus carried by seeds and seedlings of solanum fruit vegetables

发布日期：2020-12-17
实施日期：2021-01-16

前言
本标准按照GB/T 1.1-2009给出的规则起草。本标准由天津市农业农村委员会提出并归口。本标准起草单位：天津市植物保护研究所。
本标准主要起草人：王勇、高苇、张春祥、杨利娟、刘晓琳、霍建飞、姚玉荣。

1 范围
本标准规定了茄果类蔬菜种苗番茄黄化曲叶病毒检测的仪器和试剂、检测程序、结果判定、样品和菌株保存。
本标准适用于农业生产中，茄果类蔬菜种苗番茄黄化曲叶病毒的检测。

2 规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修订版）适用于本文件。
GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法

3 术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。
3.1 tomato yellow leaf curl virus (TYLCV) 番茄黄化曲叶病毒
番茄黄化曲叶病毒属于双生病毒科菜豆金色花叶病毒属病毒，因该属病毒在自然条件下只能由烟粉虱以持久方式传播，又被称为粉虱传双生病毒，是具有李生颗粒形态的植物DNA病毒，广泛分布于热带和亚热带地区，在烟草、番茄、南瓜、木薯、棉花等重要经济作物上造成毁灭性危害。番茄黄化曲叶病毒病基本信息参见附录A。
3.2 seedling borne disease 种苗传播病害
称种苗携带病原菌进行传插的一种植物病害。

4 仪器和试剂
4.1 仪器
高速离心机、灭菌锅、PCR仪、凝胶成像系统、电泳仪、旋涡振荡器、分析天平（感量1/10000g）。
4.2 试剂
4.2.1 总体要求
除另有规定外，所有试剂均为分析纯试剂，实验用水符合GB/T 6682。
4.2.2 PBS缓冲液
NaCl 8.10g、NaH2PO4 0.18g、Na2HPO4 1.97g、蒸馏水 1000mL，pH 7.4。
4.2.3 商用植物DNA提取试剂盒或DNA提取试剂
DNA提取试剂主要有Lysis缓冲液和乙酸钾缓冲液。
4.2.4 裂解缓冲液
100mM Tris-HCl pH 8.0；50mM EDTA pH 8.0；1% SDS；10μg/mL RNase A。
4.2.5 乙酸钾缓冲液
乙酸钾缓冲液 3.0M，pH 5.5。
4.2.6 凝胶电泳试剂
琼脂糖，TAE Buffer，核酸染料 Goldenview。
4.2.7 PCR试剂
Master Mix。

5 测试程序
5.1 检测样品
应以种子来源、育苗时间和育苗地点等相同的同一品种的种苗为一个种苗批次，每个种苗批不得大于1万株。如果该批种苗标记或能明显地看出该批种苗在形态或文件记录上有异质性的证据时，应拒绝取样。对一批种苗进行抽取样品时，按对角线五点、棋盘式或分层取样，每点取样10株～20株，取样应有代表性。
5.2 检测方法
5.2.1 样品的制备
将种苗样品均匀剪植株茎尖和新叶幼嫩组织，加入石英砂后于低温条件下充分研磨，获得研磨组织物。
5.2.2 DNA的提取
病毒DNA的提取可以采用商用植物DNA提取试剂盒或DNA提取试剂，按照提取步骤和方法进行，或者采用如下标准方法进行：
从研磨组织物中收集20mg～100mg研磨组织，置于5mL的离心管内（已经加入0.65mL的Lysis缓冲液），搅拌均匀。每个离心管震荡30s，然后离心2min (12000rpm/min)；将0.5mL上清液转入一个新离心管中，加入100μL乙酸钾缓冲液 (3.0M, pH 5.5)。将离心管反复倒置几次充分混匀后，再离心2min (12000rpm/min)；取0.5mL上清液转入一个新的离心管中（内含0.5mL异丙醇），将管内液体充分振荡后，离心5min (12000rpm/min)。去除上清液后加入0.75mL的70%乙醇溶液，振荡后离心30s后去除上清液，此步骤重复3次。最后去除上清液后为DNA样品，将其置于无菌、通风干燥处30min以上，待样品干燥后，将DNA溶解于10μL～200μL ddH2O中。
5.2.3 PCR检测步骤